[发明专利]一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有蛇毒激肽原酶(VK)基因的表达载体，所述蛇毒激肽原酶基因具有Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，表达载体的出发载体为pET30a。

3.如权利要求1所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，表达载体的工程菌为大肠杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌BL21。

5.一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到蛇毒激肽原酶(VK)基因；

2)将步骤1)中得到的VK基因插入到表达载体中；

3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌，并对工程菌进行诱导培养产生目的蛋白。

6.如权利要求5所述的一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述的诱导培养方法包括：待工程菌于37℃培养至对数生长期后，按3～5v/v％的接种量将菌液接种于LB液体培养基中，当OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，在温度37℃，200rpm的条件下诱导培养4h。

7.如权利要求5所述的一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，工程菌表达的目的蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，向菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有VK蛋白的上清液；所述裂解液含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、pH值为8.0；所述洗涤液含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5v/v％Triton及10mmol/L β-巯基乙醇，pH值为8.0；

2)将步骤1)中得到的上清液与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0。