[发明专利]磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法。

背景技术

固定化酶允许酶的重复或是连续使用，易于底物和产物的回收、易于纯化，在一定程度上改进了生物催化剂的性能。近年来，纳米材料如纳米粘土作为固定化酶的载体引起了人们很大的关注，原因在于其成本低、粒径小，且具有独特的插层性质；另外一个重要原因是粘土表面的硅羟基经过不同官能团活化后，可作为生物大分子的附着位点。然而，在这些研究中存在的最大问题就是固定化酶完成催化反应后载体很难被分离，而磁性材料的多相催化可以满足生物催化剂的高效分离和催化过程的持续进行，因此，磁性纳米材料改性的粘土有望成为固定化酶的优良载体材料。

已经有文献报道过磁性氧化铁/粘土纳米复合材料，然而，以往的这些研究结果显示，磁性纳米颗粒往往被固定在粘土表面，那么作为固定化酶附着位点的硅羟基便可能会被掩盖，这就限制了磁性纳米粘土材料在固定化酶领域的应用。此外，所制备这些磁性纳米材料的磁强度也非常低，不易分离，这也大大限制了其应用。

就酶固定化而言，在吸附、交联、包埋和共价偶联四种主要的载体固定化酶方法中，除吸附法外其它三种方法所制备的固定化酶，其载体都不能再生，随着酶的失活而被丢弃，这就造成了环境污染、资源浪费以及生产成本增加。虽然传统的吸附法所制备的固定化酶其载体可以再生，但载体与酶结合不牢固、酶的损失比较严重，这也就限制了它的应用。因此，设计、开发和制备可再生的载体材料就成为本课题的研究重点之一，目前有关这方面的工作罕有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种磁性纳米粒子对粘土表面影响较小的磁性纳米粘土载体固定化酶。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供该磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法。

为解决上述问题，本发明所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成，其特征在于：所述载体为磁性纳米Fe₃O₄粘土复合材料，该磁性纳米Fe₃O₄粘土复合材料由磁性Fe₃O₄纳米粒子和纳米粘土材料组成，且磁性Fe₃O₄纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。

所述磁性纳米Fe₃O₄粘土复合材料是指首先将FeCl₃·6H₂O以1：20~1：50的料液重量体积比溶解于乙二醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚乙二醇加入到所述澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到所述澄清溶液中，超声分散1~5h，得到混合液；最后将所述混合液加入到聚四氟乙烯衬里的不锈钢反应釜中，维持160~210℃反应5~24h即得；其中所述NaAc与所述澄清溶液的重量体积比为1：7~1：18；所述聚乙二醇与所述澄清溶液的重量体积比为1：20~1：50；所述盐酸活化的纳米粘土与所述澄清溶液的重量体积比为1：60~1：150。

所述盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按1：20~30的料液重量体积比放入浓度为1~3 M的HCl 溶液中，在20~40℃温度下超声0.5~2 h进行活化后，经离心分离并洗涤至上清液呈中性，再离心分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重后研磨、过30~60μm筛子即得。

如上所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，其特征在于：所述纳米粘土为凹凸棒、高岭土、蒙脱土中的任意一种。

如上所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

⑴将磁性纳米Fe₃O₄粘土复合材料以1：40~1：80的料液重量体积比浸泡在二甲苯溶液中2~4h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将γ-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到所述二甲苯溶液中；在90~130℃下油浴加热回流，且N₂保护下反应6~15h，反应结束后乙醇洗涤三次，经磁分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重，得到改性的磁性纳米Fe₃O₄粘土复合材料，记为Fe₃O₄粘土-NH₂；其中所述γ-氨基丙基三乙氧基硅烷与所述二甲苯溶液的重量体积比为1：8~1：12；