[发明专利]一种快速提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取DNA的方法。

背景技术

在生命体内，核酸和蛋白质是生命最重要的物质。核酸携带遗传信息，指导蛋白质的合成。它们的关系紧密相联。在为进行核酸水平上的遗传研究或临床检测，从一些生物样本，例如动物细胞、血清、血液等，提取核酸时，却常常遇到的主要问题是如何去除含量丰富的蛋白质。

本领域技术人员所熟知的一种有效方法是酚/氯仿抽提，但这种方法是非常耗费时间和劳动力。

一种可选方法是利用SDS、蛋白质和K离子形成不溶于水的复合物，通过离心去除含蛋白质的沉淀。这种方法普遍用于提取质粒，即所称的碱裂法。申请号为201010153890.1，名称为：血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法中国发明采用该方法提取全血DNA。事实上，该方法并不能彻底去除蛋白质，常常可见带颜色的上清液。

另一种可选的方法是盐析法，利用了蛋白质在高浓度盐的溶液溶解度低而析出的物理特性，通常使用单价金属盐如钠盐、铵盐、钾盐等。如Miller S.A.,等人NucleicAcids Res.,16(1988)3中报道的方法，其过程是先通过低渗溶液裂解去除占据99%全血细胞不含DNA的红细胞，再裂解含DNA的白细胞，然后加入饱和的氯化钠析出蛋白沉淀，离心沉淀后含有DNA的上清液再通过乙醇沉淀分离出DNA。在操作中，技术人员发现，血红蛋白残留过多时往往无法彻底清除，如果直接裂解全血，则无法用该方法实现去除蛋白的目的。

蛋白质去除后，接着是从含DNA的上清液中分离出DNA，这个过程称为纯化。本领域技术人员熟知的一种方法是添加乙醇或异丙醇纯化DNA，并且熟知这是一种耗时费力的方法。

另外，本领域技术人员同样熟知在离液盐的存在下核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子(Vogelstein,B.,和Gillespie,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)，并为核酸的色谱纯化和分离过程奠定了基础。令人惊奇的是，二氧化硅材质能特异性吸附核酸，且不吸附蛋白，糖类、脂类和常用的盐类，基本原理还未见相关文献叙述。本领域还已知使用高浓度的离液盐如碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸胍从胞溶产物中分离和纯化DNA的方法。例如，在Boom,R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503中，描述了使用异硫氰酸胍和玻璃颗粒提纯人体样本如全血、血清和尿液等的方法。该方法是用异硫氰酸胍裂解人体样本，并作为结合剂使DNA吸附至玻璃颗粒表面，同样的描述也可见US5234809。然而，采用玻璃颗粒形式的纯化方法需要多次重悬操作并在溶解DNA之前为为了彻底去除干扰下游应用的乙醇，通常需要较长时间的干燥。

另一种可选的方式是磁珠法。磁珠表面包被硅胶或标记功能基团，例如氨基、羧基等，磁珠吸附DNA后，在磁场的作用下，DNA-磁珠复合体吸附至管底或管壁，除去不含DNA的上清液，洗涤和洗脱DNA-磁珠复合体，获得纯化的DNA溶液。这种方法有效地实现了DNA提取的自动化，但手工操作时，与玻璃颗粒的纯化方式同样需要多次的重悬步骤并也需长时间干燥。

如上所述的方法，在需检测大量样本及迅速发报结果的疾病临床诊断中是受限的。

一种快速提取DNA的可选方法，如Jakobi,R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中的描述，使用玻璃纤维过滤器纯化M13噬菌体DNA的方法。该方法通过聚二乙醇/氯化钠使噬菌体粒子沉淀并用高氯酸盐使噬菌体粒子胞溶而分离DNA，洗涤与DNA结合的玻璃纤维过滤器，然后用TE溶液洗脱。玻璃纤维过滤器是一种快速纯化DNA的方法，无需添加特别的去除蛋白质的步骤，仅通过短时间离心过滤含非DNA的其它生物样本释放的组分诸如蛋白质、脂类等和盐等污染物，并使DNA迅速结合于纤维膜上，且用短时间高速离心干燥纤维膜。这种方法被市售示例性产品如Qiagen公司的全血小量提取试剂盒所采用。此类产品用于提取全血的过程较简单，先在盐酸胍和蛋白酶共同的作用通过55摄氏度温育10分钟以裂解生物样本并释放DNA，再通过加入乙醇调节结合条件，将含DNA的混合液转移至硅胶柱，离心使DNA吸附至硅胶膜上，然后洗涤和洗脱DNA。因其简便性，成为现有纯化DNA技术中的主要方法，但技术人员在使用时注意到，不加蛋白酶降解蛋白质会导致裂解液无法通过硅胶柱。因此，蛋白酶酶解过程是该方法所必需。但蛋白酶通常比较昂贵，这使得成本居高不下。