[发明专利]重组人亲环素A抗体、其制备方法及ELISA试剂盒以及细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子生物学与免疫学领域，具体的是说一种重组人亲环素A抗体、其制备方法及ELISA试剂盒以及细胞株。 

背景技术

目前已发现和克隆的亲环素有130多种异构体，它们构成了Cyclophilins家族，广泛分布于细菌、真菌、植物和哺乳动物中，在进化的过程中比较保守。亲环素最初是作为环孢菌素A(CyclosporinA，CsA)的蛋白受体被发现的，环孢菌素A是一种免疫抑制剂，临床上用于治疗器官移植产生的排斥反应及自身免疫系统疾病，所以亲环素被认为参与了免疫抑制过程。后来大量的研究表明，亲环素还具有其它许多重要的生物学功能，CyPs具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性，催化蛋白质折叠过程，尤其是富含脯氨酸的蛋白质折叠，同时还介导细胞间信号转导和细胞凋亡、参与HIV-1病毒蛋白组装,参与炎症反应等。 

人类亲环素A(Cyclophilin A，CypA)基因位于7p13，编码的蛋白质含165个氨基酸，相对分子质量为18×10⁶，主要存在胞质内。CyPA含一个由8条反平行β链构成的桶状结构，7个芳香族及其他疏水残基在桶内形成了一个紧凑的疏水核心，该区域正是环孢素的结合部位。 

鉴于以上所述的亲环素生物学功能，近年来，大量的研究表明，CypA与风湿性疾病（如风湿病）、肿瘤（如胰腺癌非小细胞癌）、炎症（如皮肤银屑病，结肠炎、胰腺炎），免疫性疾病（如红斑狼疮）及病毒感染（如乙肝病毒感染）有密切的关系。 

对于CypA蛋白的检测，免疫学方法无疑是最为方便的一种，如果用免疫学方法检测需要首先建立检测的方法，并制备试剂盒，试剂 盒的核心组分-抗体的制备传统的方法是：用重组蛋白生产抗体，一般的流程是：先培养并诱导表达菌,收集并裂解诱导后的表达菌,带标签的重组蛋白通过标签纯化之后需要使用蛋白酶切除载体融合标签蛋白，不带标签的重组蛋白根据蛋白质特性进行纯化，如果表达蛋白在包涵体里面则包涵体纯化的方法进行,蛋白纯化在目前还是生物学领域的一打难题，需要借助很多手段综合运用，不但如此，往往蛋白的纯度和可溶性都不高,生物活性更难以保证；如果制备抗体，需要用以上纯化的蛋白免疫动物实验，最后再用这纯化的蛋白作为亲和配体来纯化抗体。这样做的程序繁琐，蛋白酶的成本高，不适合大规模工业生产，并且每多一步操作，不但蛋白量损失至少20%（表2），蛋白免疫学活性损失 30%左右（表3）；如果重组蛋白在包涵体中表达，重组蛋白的纯化就更加困难；由于菌体中有很多种蛋白存在，使用任何方法纯化，过程中都难免遇到结构或者性质与目标蛋白类似的菌体蛋白，这类蛋白在纯化过程中很难清除，造成纯化的蛋白纯度不高，有时候通过跑SDS-PAGE胶也很难看清楚，以此蛋白（作为抗原）来免疫动物并以此作为亲和纯化抗原配体纯化得到的抗体或者筛选单克隆抗体细胞株来生产的抗体中必然有一部分是针对残留在纯化蛋白（抗原）中大肠杆菌菌体蛋白的，而人在生活中每天都会接触大肠杆菌，体内也有一些抗大肠杆菌菌体蛋白的抗体，如果以上述方法生产的实际盒来检测人体标本，毫无疑问肯定会对真实的结果引起干扰，造成试剂盒性能下降甚至是无效。 

发明内容

本发明目的是为了解决上述抗体生产中存在的技术问题，提供一种工艺条件简单、特异性好、纯化简单、蛋白免疫学活性损失少、操作简便的重组人亲环素A抗体的制备方法。 

本发明还提供一种由上述方法制得的重组人亲环素A抗体。 

本发明还提供一种含有上述重组人亲环素A抗体的重组人亲环 素A 的ELISA试剂盒。 

本发明还提供一种只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株，为一种杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株12C28，其来源种属的拉丁文学名Mus musculus，保藏该细胞株的单名称为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址是：中国武汉 武汉大学，保藏日期为2012年5月7日，保藏编号为CCTCC  C201259。 

本发明重组人CypA抗体的制备方法包括以下步骤： 

（1）扩增人CypA编码区基因，通过酶切位点装入原核表达载体pET-28a，得到重组表达质粒p28a-CypA; 

（2）将重组表达质粒p28a-CypA转化至大肠杆菌BL21，加入诱导剂诱导CypA蛋白的表达，得到诱导后菌体； 

（3）收集并破碎诱导后菌体，再通过免疫实验动物制备多克隆抗体血清，然后再通过差异性中和法去除多克隆抗体血清中的非针对CypA蛋白的非特异性蛋白抗体，得到含有只针对CypA蛋白的多克隆特异性蛋白抗体的血清；