[发明专利]一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列及其克隆方法

权利要求书

1.一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列，该基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于：该基因的所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQID NO.2所述。

3.依照权利要求1所述的一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：

(1)总RNA的提取和纯化：

采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA；

(2)中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤(1)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code：D314)试剂盒中3′RACE Adaptor进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物(jf2)和下游引物(j×2)，进行PCR扩增。

磷脂酶Dα1基因中间片段扩增引物：

jf2：5′-GCCCAAARGAGCTTTCACTY-3′，

jx2：5′-GAAGMARGTGACCRGGAAGG-3′；

扩增得到新疆沙冬青的磷脂酶Dα1基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。

(3)3′端的克隆：

C、3′-outer PCR扩增

根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3′-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP2-3′-outer和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code：D314)试剂盒中3′端下游引物3′-RACE outer，进行3′端outer PCR扩增： 

磷脂酶Dα1基因3′端的特异性上游outer引物：

GSP2-3′-outer：5′-GGATGGTGCTAGGGACTCTGAGATTGCC-3′；

3′端下游引物3′-RACE outer：

3′-RACE outer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′；

扩增得到的产物为cDNA3′端；

D、3′-inner PCR扩增

根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3′-inner，以前述步骤C所得3′端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP2-3′-inner和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code：D314)试剂盒中3′端下游引物3′-RACE inner，进行3′端inner PCR扩增：

磷脂酶Dα1基因3′端的特异性上游inner引物：

GSP2-3′-inner：5′-CCACGGTCTTCGCATGGCATTGTGGTAT-3′；

3′端下游引物3′-RACE inner：

3′-RACE inner：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′；

扩增得到的产物为cDNA 3′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3′端完整序列；

(4)5′端的克隆：

E、合成5′端的cDNA第一链：

以上述步骤(1)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司 RLM-RACE Kit，SKU#：AM1700试剂盒对RNA处理，加入下述5′RACE Adapter后，以Random Decamers进行反转录：

5′RACE Adapter：5′-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3′；

合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链；

F、5′-outer PCR扩增

根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5′-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP2-5′-outer和 RLM-RACE Kit试剂盒中的5′端上游引物5′-RACE outer，进行5′端outer PCR扩增：

磷脂酶Dα1基因5′端的特异性下游outer引物：

GSP2-5′-outer：5′-CATGGCAATCTCAGAGTCCCTAGCAC-3′； 

5′端上游引物5′-RACE outer：

5′-RACE outer：5′-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端；

G、5′-inner PCR扩增

根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5′-inner，以前述步骤F所得5′端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP2-5′-inner和 RLM-RACE Kit试剂盒中5′端上游引物5′-RACE inner，进行5′端inner PCR扩增：

磷脂酶Dα1基因5′端的特异性下游inner引物：

GSP2-5′-inner：5′-TTCATCATCAACTATCATCATCTTGG-3′；

5′端上游引物5′-RACE inner：

5′-RACE inner：5′-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5′端完整序列；

(5)全长序列拼接和基因分析

将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3′端inner PCR扩增序列和步骤(4)所得5′端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORF finder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。

(6)磷脂酶Dα1基因的克隆：

将上述步骤(4)合成5′端的cDNA第一链作为模板，设计上游引物ORF2-S和下游引物ORF2-A，并进行PCR扩增：

磷脂酶Dα1基因扩增引物：

ORF2-S：5′-ATGGCACAGATTCATCTTCATGGAA-3′，

ORF2-A：5′-CTATGTGGTAAGGATTGGAGGCATG-3′；

扩增得到的产物为完整的新疆沙冬青的磷脂酶Dα1基因，通过克隆测序，即得其基因序列。