[发明专利]一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品分析技术领域，涉及一种分析检测食品中过敏原的方法。

背景技术

乳制品是人们重要的食物蛋白来源，同时又是易引起特定人群过敏的食物，严重危害着消费者健康。解决食物过敏的首要任务是检测过敏原，以便于过敏食物的风险评估、生产和标示。美国和欧盟对八大类主要过敏食品均要求标示以提醒消费者。乳制品中过敏成分复杂，据统计，超过51％牛乳过敏患者的过敏原是α-乳白蛋白。因此，开展针对α-乳白蛋白的检测，对预防乳制品引发的过敏具有重要意义。

目前，食物过敏原检测有PCR、RT-PCR、HPLC、ELISA、液-质联用等技术，这些技术价格昂贵、费时、灵敏度和特异性低，应用受到限制。由于激发食物过敏反应的阈值有个体化差异，加之，过敏食物中过敏成分复杂，因此，建立高效、特异、灵敏的食物过敏原检测新技术是未来发展趋势。

量子点是一种直径在1-100 nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，具有宽激发、窄发射、发射峰可调以及荧光寿命长等优良特性。近年来，在医学、生物学领域，人们集中研究用量子点代替传统的化学荧光标记物用于免疫学检测。根据量子点的这些光学特点，以其标记单克隆抗体建立免疫吸附技术可定量检测食品中过敏原，将大大提高检测方法的灵敏度和特异性。目前，在我国，利用荧光量子点标记单抗技术针对食品中过敏原快速定量检测还是空白。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于荧光量子点定量检测粉剂和液态奶制品中过敏原α-乳白蛋白的方法。该方法准确、快速、操作简单、特异性好、灵敏度高。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下。

1、α-乳白蛋白单克隆抗体的制备。

以α-乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体。

2、量子点偶联单克隆抗体。

量子点偶联单克隆抗体采用碳二亚胺法。选用羧基修饰后的CdSe/ZnS量子点，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）两种偶联剂的作用使量子点表面羧基与α-乳白蛋白单克隆抗体表面氨基共价偶联。

偶联时，量子点、EDC、NHS和α-乳白蛋白单克隆抗体按照1:10:6:4的摩尔比进行偶联。其中EDC、NHS均用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制，取量子点加入EDC溶液中室温涡旋活化5 min后，再加入一定量的NHS溶液反应5-10min，最后取α-乳白蛋白单克隆抗体加入反应液后涡旋混匀，置于37℃摇床上避光反应1.5-2h。偶联结束后，将偶联产物用截留分子量为3kDa的超滤管超滤除去剩余的偶联剂，并浓缩至200-300 μL。

3．量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体的纯化。

采用Sephadex-G200凝胶层析柱纯化偶联产物，去除未反应的α-乳白蛋白单克隆抗体和量子点。首先，利用磷酸盐缓冲液（PBS）平衡层析柱，流速0.2 mL/min；取经超滤后偶联混合物上样，上样结束后，开始用PBS洗脱，同时打开自动收集器收集洗脱液；由于偶联产物中的量子点标记单抗分子量比游离α-乳白蛋白单克隆抗体大，在凝胶过滤层析时，量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体先被洗脱出来，游离单抗稍后被洗脱出来（见图1）。洗脱结束后，利用超滤管浓缩两个洗脱峰，并在荧光紫外灯下观察，发现峰a有荧光，而峰b未见荧光，所以判断峰a为纯化后的量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体。

4．荧光吸收光谱分析。

将量子点及偶联产物分别用PBS稀释后置于比色皿中，365 nm激发光激发，在350-700 nm范围内扫描发射波长，对比偶联前后量子点最大发射峰峰值变化（图2）。从图谱2中a可知量子点在575nm处有发射峰，而偶联抗体量子点在572nm处有发射峰，蓝移3nm，同时荧光强度增强。引起发射峰位变化的原因可能是CdSe/ZnS量子点表面的羧基与抗体表面氨基共价偶联后，使量子点的表面电荷数减少，从而降低了量子点间的偶极与偶极的相互作用，导致Stokes位移减小，其荧光发射峰发生了蓝移，由此证明偶联过程顺利且有效。

5．竞争性FLISA法检测α-乳白蛋白的标准曲线绘制。