[发明专利]高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因FSI-A124

说明书

技术领域

本发明涉及一种可高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因FSI-A124。

背景技术

木聚糖是自然界中继纤维素之后第二丰富的再生生物资源，广泛存在于糠麸、玉米芯、稻草、甘蔗渣和秸杆等农业副产品中。在养殖业、酿酒工业和造纸工业中木聚糖具有副作用，但其也可用于低聚木糖、液体燃料等高附加值产品的生产。木聚糖酶能够特异性降解木聚糖，可广泛应用于食品、饲料和造纸等工业中，深入开展木聚糖酶的研究对于相关产业的发展具有要作用。在工业应用上，木聚糖酶的理想特性是同时具有较宽的最适温度和pH，良好的热稳定性和pH稳定性，以及具备较好的底物结合、水解性能，然而此类理想型的木聚糖酶很难从自然界直接获取，因此需要利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造。木聚糖酶的性质取决于酶分子的结构，传统的菌种选育方法难以在短期内达到预期目的。因此，开展提高木聚糖酶热稳定性和底物结合水解性能的研究具有重要的理论意义和应用价值。

微生物产生的木聚糖降解酶系复杂，同时分泌多种水解酶。如褐色高温单孢菌木聚糖酶（Thermomonospora fusca）分泌降解木聚糖的酶包括内切木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯木聚糖酶；C. thermocellum 中包含至少15种纤维素酶基因、两种木聚糖酶基因和两种β-糖苷酶基因。这些酶性质相近，有的为同工酶，使得野生型木聚糖酶分离纯化和酶学性质研究难度较大。近年来嗜极端酶成为研究的热点，直接培养极端微生物来分离嗜极端酶相当困难，而实现木聚糖酶工业化生产的必要条件是获得能大量表达木聚糖酶的微生物菌株，只有采用分子生物手段构建基因工程菌才能使耐热木聚糖酶的生产成为现实。

蛋白质分子改良是改造酶基因的有效手段，将不同来源的序列进行融合重组，所得到的杂合木聚糖酶有可能集中其亲本的优良特性。黑曲霉木聚糖酶A（Aspergillus niger xylanase A, AnxA）为G/11家族真核生物来源的木聚糖酶，比活较高，但热稳定性较差。褐色高温单孢菌木聚糖酶A（T. fusca xylanase A, TfxA）为原核生物来源木聚糖酶，是目前G/11家族中热稳定性最好的木聚糖酶之一，但酶比活较低。序列分析表明，TfxA等多数G/11家族木聚糖酶的催化结构域氨基酸总体同源性较高，但N-末端氨基酸序列同源性很低且在二级结构单元存在较大差异，这表明TfxA的N-末端结构可能与其较高的热稳定性相关。目前，已见原核生物来源木聚糖酶与TfxA杂合提高其热稳定性的研究，但有关真核生物来源木聚糖酶与TfxA杂合，以提高其热稳定性和催化活性的研究报道甚少。本研究采用“半理性”设计杂合AnxA和TfxA的N段36个氨基酸序列，获得酶活性和稳定性提高的杂合木聚糖酶基因atx，之后采用“非理性”设计得到催化活性进一步提高的突变体基因FSI-A124，并构建了能高效表达突变体基因的重组毕赤酵母工程菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因FSI-A124。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因FSI-A124，该基因通过两个异源木聚糖酶基因：anx（GenBank: FJ772090）和tfx（GenBank: U01242）基因经N-端交叉重组得到的杂合基因atx，atx再经蛋白质体外定向进化改造而来；FSI-A124的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明的有益效果是，本发明的杂合木聚糖酶FSI-A124获得了高活性木聚糖酶Anx高的A和高热稳定性木聚糖酶TfxA的双重优良特性，即具有高活性的同时也具有较稳定性。其最适温度为55℃，最适pH为6.0，在70℃以下较为稳定，其残余活性均大于60%，可进行工业化加工及生产。

附图说明

图1是水解产物木寡糖（X-X5）的保留时间示意图；

图2是水解产物木寡糖（X-X5）的含量图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅限于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1. atx基因的分子设计（半理性设计）