[发明专利]应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断仪器领域，特别涉及一种斑点阅读仪中微孔板孔底图像精确定位方法。

背景技术

ELISPOT技术即酶联免疫斑点检测技术，它是一种免疫学检测技术。该技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术）的长处，具备一系列的优点：灵敏度极高，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，能检测活生生的免疫细胞的功能与状态，而且操作简单经济，可进行高通量筛选等。它是当今唯一能够检测到百万分之一阳性细胞率的检测技术，灵敏度比普通ELISA技术、流式细胞技术（细胞内细胞因子染色）和Tetramer技术至少高了1-2个数量级。这些独特优点使其成为抗原特异性T-细胞免疫学研究的主流技术。

ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞比例。细胞总数在试验开始已经计数，需要统计的是阳性细胞（也称斑点形成细胞数目）。根据以前的技术研究，每一个ELISPOT斑点对应唯一一个阳性细胞，所以ELSPOT数据处理最重要的工作就是进行斑点计数。

事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘的、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此要求。

ELISPOT斑点阅读仪在分析ELISPOT实验数据的过程中，先拍摄微孔板中孔底载体上（如膜）呈色影像，而后储存成各种数据格式的图像文件，包括未处理与处理过的膜表面影像；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果采取自动分析功能，则利用仪器的内嵌分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。ELISPOT斑点分析仪能自动进行图像扫描并分析，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。

但是，对微孔板的每个孔来说，所拍摄的图像不仅包含了分析所需要的孔底信息，还包括了孔底之外的图像。因此首先要做的是找到孔底圆，把圆之外的图像部分减去，然后在裁剪之后的图像上继续进行图像分析。常见的思路是通过机电结构，例如步进电机、丝杆或者同步带，精确控制每个孔运动到固定位置，这样拍摄的时候就可以认为每个孔的位置是固定的，同是也认为孔底圆的大小是不变的，从而以固定位置的、固定大小的圆去裁剪所拍摄的图片。但实际上，由于机电结构的精度、制造误差以及微孔板本身的制造误差、板条装配较松等原因，以图像中固定位置圆裁剪所拍摄图片，所得结果和真实孔底位置有较大的偏差，偏差方向没有规律。另外一个问题是，由于制造公差等原因，每孔的孔底圆的大小实际上不一样的，所以成像后对应的圆的大小也是不一样的，用固定大小的圆裁剪，会导致：或者裁掉有用的孔底图像，或者包含了多余的孔外干扰图像。总之，用固定大小、固定位置的裁剪圆不能精确定位微孔板的孔底，导致裁剪到图像不仅丢失了所需要的真实孔底信息，还包含进了孔底之外的很多干扰信息，从而导致了后续图像分析失去真实性基础，分析结果没有意义。对于传统加工制造业中的图像分析来说，由于光照控制容易、背景及目标对比度可以非常强，工况也相对固定，所以实现起来容易。但Elispot的微孔板图像是生化反应后的图像，图像的深浅不定、均匀性的规律也很差，是一种类似自然场景的图像，要进行图像分析是相对复杂的一个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种斑点阅读仪中微孔板孔底图像精确定位方法，能保证Elispot斑点阅读仪进行图像分析时能对微孔板孔底进行精确裁剪，克服了传统技术中的不足，从而实现本发明的目的。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

应用图像识别对Elispot斑点分析的自动精确定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）拍摄原始微孔板的原始图像；

2）对原始图像进行灰度化处理，得到灰度图像；

3）对灰度图像进行二值化处理和边缘检测，获取边缘线条的二值图像；

4）对二值图像进行进行孔底圆查找，得到所有目标圆的半径及圆心；

5）按照得到的目标圆的半径及圆心对原始图像进行裁剪，即得到去掉无关信息的目标图像。

在本发明的一个实施例中，所述步骤2）中灰度化的方法为采用以下公式把原始图像转换为灰度图像：