[发明专利]一种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白及酵母转化体

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞膜穿透性重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白和表达该蛋白毕赤酵母表达菌株，及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

对虾是世界上养殖产值最大的水产种类之一，在我国水产养殖中也占有举足轻重的地位。随着对虾养殖业的迅速发展，由于集约化养殖水域生物负载过大等多方面问题，导致了对虾病害流行，其中，对虾病毒感染引发的病害造成了巨大的经济损失，同时也威胁着整个海洋生态的平衡。对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一，自1992年爆发以来，给全球对虾养殖业造成了巨大损失。因此，深入开展对虾免疫机制研究并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法已成为当务之急。

Fortilin蛋白，即翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP），是一种广泛表达，高度保守的真核蛋白家族。研究发现，Fortilin蛋白是一种多功能蛋白，具有重要生物学功能，包括调节细胞周期进程和恶性转移、钙结合功能、细胞外组胺释放活性、抗凋亡及抗疟疾作用等。

Bangrak等2004年克隆了斑节对虾Fortilin-Pm-Fortilin，Pm-Fortilin具有保守的Ca结合结构域，并具有抗凋亡活性。RT-PCR分析发现WSSV感染濒死斑节对虾血液中Fortilin mRNA表达量远低于正常水平，该基因在WSSV爆发时高表达，表明Fortilin可能在保护斑节对虾免受WSSV侵染中起到一定作用。

后续研究表明，Pm-Fortilin具有保护对虾抵抗WSSV的作用；对虾注射重组Fortilin（rFortilin）后，进行WSSV感染，存活率达80-100%，且PCR检测WSSV处于低水平，而濒死的对虾WSSV水平很高。此结果表明，注射重组rFortilin能以未知的机制降低病毒感染，推测可能是抑制病毒复制。近期有学者利用昆虫sf9细胞研究Fortilin和病毒基因之间的相互作用，结果显示，Pm-Fortilin抑制WSSV早期基因WSSV DNA polymerase和晚期基因VP15，VP28的表达，结合前期研究结果，表明Fortilin通过Ca²⁺信号和转录控制干扰WSSV增殖。但是，口服重组Fortilin组对虾攻毒后存活率仅为10%。药物注射费时费力，显然不适用于大规模对虾养殖，那么如何提高口服效用，以方便的饲用方式应用于实际生产是亟待解决的问题。

Fortilin蛋白具有重要的抗病毒作用，但其口服利用效率差难以应用于对虾养殖生产，这也是活性蛋白和多肽应用普遍面临的问题。因此，本发明从养殖应用出发，着眼于提高蛋白转运效率，以细胞穿膜肽引导Fortilin跨膜转运，同时以酵母作为运载体系，为蛋白应用寻找一种新的方便有效的方式。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白及酵母转化体，即对凡纳滨对虾的Fortilin蛋白进行改造，并在毕赤酵母中实现稳定、分泌表达，可提高对虾机体免疫力，方便的应用于对虾养殖生产中白斑病毒的防治，从而弥补现有技术的不足。

本发明一个方面涉及一种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。

其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

本发明另一个方面涉及用于表达重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白的酵母转化体，一种转化体，为巴斯德毕赤酵母X-33/pGAPZαA-FT（Pichia Pastoris X-33/pGAPZαA-FT），已于2012年4月5日保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012097。

上述的酵母转化体在制备凡纳滨对虾免疫增强剂中的应用。

一种凡纳滨对虾免疫增强剂，是将巴斯德毕赤酵母X-33/pGAPZαA-FT的发酵上清液冻干制备的。