[发明专利]一种榉树无菌播种方法

权利要求书

1.一种榉树无菌播种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1.1外植体的采集、消毒

收集榉树种子，将采回的种子用清水浸泡1天，再用洗洁精搓洗，然后用去离子水清洗1～3次，置于超净工作台上去种皮，将去除种皮的成熟合子胚用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗1～3次，再用0.1％HgCl₂以振荡的方式进行灭菌处理 4～6 min，用无菌水冲洗3～5次，

1.2成熟合子胚愈伤诱导、愈伤增殖、芽分化培养、单芽生根培养

将消毒好的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.0～2.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养，培养条件为25±2℃，1000～1500LX，每天光照10～14 h为宜，30 d后将诱导的大团愈伤组织分割成小团，转接到改良WPM+6-BA0.5～1.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织的增殖，愈伤组织增殖到一定数量后，转入改良WPM+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0～1.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的分化培养基上，诱导愈伤组织分化出芽，

将诱导出的株高1.0cm以上的单芽剪下，接种到生根培养基1/2改良WPM+ IBA 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖20000 mg·L^-1+琼脂5000 mg·L^-1中诱导生根，

其中，所述改良WPM培养基的组成为：

KNO₃                   900mg·L^-1

NH₄NO₃                 400 mg·L^-1

CaCl₂.2H₂O              264 mg·L^-1

MgSO₄.7H₂O              370 mg·L^-1

Ca(NO₃)₂. 4 H₂O           556 mg·L^-1

KH₂PO₃                  270 mg·L^-1

MnSO₄.4 H₂O             22.3 mg·L^-1

ZnSO₄.7 H₂O             8.6 mg·L^-1

FeSO₄·7H₂O              27.8mg·L^-1

Na₂-EDTA·2H₂O          37.3mg·L^-1

CuSO₄.5 H₂O             0.025 mg·L^-1

H₃BO₃                   6.2 mg·L^-1

Na₂MoO₄.2 H₂O           0.25 mg·L^-1

KI                     0.83 mg·L^-1

CoCl₂.6 H₂O             0.025 mg·L^-1

维生素B1               0.4 mg·L^-1

维生素B6               0.5 mg·L^-1

烟酸                    0.5 mg·L^-1

甘氨酸                  2.0 mg·L^-1

肌醇                    100 mg·L^-1。