[发明专利]制备成熟胰岛素多肽的方法

说明书

本申请是国际申请日为2006年8月15日的国际申请PCT/EP2006/065303进入中国、申请号为200680029943.0的题为“制备成熟胰岛素多肽的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及在酵母中制备成熟人胰岛素类似物的方法。

背景技术

胰岛素是在胰岛β细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处切割C-肽形成。A-和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19 Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子还在A6和A11位Cys残基之间有一个内部二硫键。

在开发出重组DNA技术之后，已经描述了许多在基因修饰宿主细胞中生产胰岛素及其前体的方法。因此在例如Frank，B.H.，Pettee，J.M.，Zimmerman，R.E.& Burck，P.J.In：Peptides Synthesis-Structure-Function.Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium(D.H.Rich和E.Gross，eds).Pierce Chemical Company，p.729(1981)中公开了从大肠杆菌(E.coli)中制备胰岛素的方法。由于大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行折叠的细胞机器且不确立在成熟胰岛素中连接A-和B-链的二硫键，所以，该策略包括了许多体外加工步骤，比如在重折叠过程中体外确立二硫键以及随后的C-肽切割。

与大肠杆菌形成对比，真核生物包含折叠和确立二硫键所必需的机器，且由此看来似乎是用于在基因修饰生物中生产成熟胰岛素的好候选者。美国专利US 4,914,026公开了一种在酵母中生产成熟胰岛素的方法，其通过下述实现，在酵母宿主细胞中插入与酵母α-因子前导序列相连的人胰岛素原基因并在一定条件下使转化酵母细胞在营养培养基中生长，由此表达和分泌成熟形式的胰岛素原。

Thim等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，第83卷，第6766-6770页，公开了人胰岛素原以及多种带有经过修饰的C-肽的胰岛素前体的表达，所述经过修饰的C-肽例如RREAENLQKR(SEEQ ID NO：1)、RREAPLQKR(SEQ ID NO：2)、RREALQKR(SEQ IDNO：3)、KREALQKR(SEQ IDNO：4)和RRLQKR(SEQ ID NO：5)。SEQ ID NO：5还公开于Thim等人，FEBS Letters，第212卷，第2期，第307-312页。

此外，WO 97/03089公开了式为BZA的胰岛素前体的表达，其中B和A是通过至少一个二硫键相连的人胰岛素A和B肽链，Z是包含至少一个蛋白酶剪切位点的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQ ID NO：6)。

然而，所公开的胰岛素前体仅在培养基中产生微量分泌的成熟胰岛素。

欧洲专利申请0163529A、PCT专利申请号WO 95/02059和WO90/10075公开了基于胰岛素或胰岛素类似物前体在酵母中的表达来制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，这些胰岛素或胰岛素类似物前体在从发酵液体培养基中初始回收后被酶促转化为成熟胰岛素或胰岛素类似物。这些前体分子包含特定的经过修饰的C-肽，且还包含胰岛素B-链的N-末端延伸。经过修饰的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被设计成不在酵母中细胞被切割，且由此前体作为单链肽分泌，其中A-和B-链仍然通过经过修饰的C-肽连接但具有正确定位的二硫键。之后通过许多随后的体外酶促步骤以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰岛素或胰岛素类似物产物。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且导入随后在进一步的下游加工步骤比如昂贵的层析步骤等中必须被除去的额外杂质。

美国专利号6,348,327中公开了在不能天然形成分泌颗粒的基因工程改造的动物细胞中制备成熟胰岛素的方法。

本发明的目的是开发能够分泌完全加工的成熟人胰岛素类似物的真菌菌株，由此避免昂贵且费时的下游纯化方法步骤。

发明内容