[发明专利]一种独一味组织培养离体快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养和离体快速繁殖，尤其涉及一种独一味组织培养离体快速繁殖方法。

背景技术

独一味是唇形科（Lamiaceae）独一味属多年生无茎草本植物，又名独步通，藏语亦称“大巴”、“打布巴”，产于我国青海、西藏、四川、云南西北部、甘肃，生于海拔2700~4500m的高山草甸、河滩草甸。独一味味苦、微寒，根及根茎或全草入药，药材表面枯黄色或黄褐色，质坚硬、干枯、气腥臭，是我国藏、蒙、纳西等民族民间常用草药之一，具有止血、镇痛、活血化瘀、抗菌消炎、增强免疫力等作用，藏医将其用于骨髓炎、关节黄水病、骨折、跌伤、枪伤等。在我国一千多年前的藏医学名著《四部医典》和《晶珠本草》中就已有记载。藏药独一味生长周期长，随着奇正炎痛贴、独一味片及胶囊等国家级新药的大量生产，独一味药材已供不应求。而独一味药材长期依赖野生采挖来满足国内外市场需求，种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少。尤其是近年来随着国内外对独一味需求量的增加，大量掠夺性采挖，使独一味逐渐成为濒危植物，面临物种丧失、资源枯竭的危险，因此进行种质资源保护和扩大独一味繁育势在必行。

植物组织培养技术是利用细胞的全能性（即个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。），取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义：⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖；⑵便于保持优良生物学特性；⑶在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的独一味突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。

本发明首次采用无菌苗幼根为外植体进行组织培养方法，开展野生独一味种质离体繁殖研究工作，这为挽救珍稀藏药独一味种质资源，开展遗传改良、促进独一味的工厂化育苗提供了一条新途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种易于操作、可进行大规模工厂化生产的独一味组织培养离体快速繁殖方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：

⑴外植体的选择和消毒处理：选颗粒饱满的独一味种子，52℃的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素溶液中浸泡1h后，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15~30秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0.1%~0.2%的升汞中，浸泡灭菌5~8分钟，并用无菌去离子水冲洗3~6次后接种到MS无激素培养基上，其中每25ml所述MS无激素培养基中接种4粒所述消毒后的种子；3~4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体；

⑵外植体接种：将所述外植体切成0.3~0.5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml所述愈伤组织诱导培养基中接种2小段所述外植体；在温度为25℃±2℃、光照强度为30~60 umol . m^-2. s^-1、光照时间为12~14 h .d^-1的条件下培养10~25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织；

⑶愈伤组织增殖：将所述愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，其中每25ml所述愈伤组织增殖培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25℃±2℃、光照强度为30~60 umol . m^-2. s^-1、光照时间为12~14 h .d^-1的条件下愈伤组织增殖20~35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织；

⑷愈伤组织的芽诱导：将所述步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml所述诱芽培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25℃±2℃、光照强度为30~60 umol . m^-2. s^-1、光照时间为12~14 h .d^-1的条件下培养30~35天，形成丛生芽；

⑸丛生芽的增殖：将所述丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml所述芽增殖培养基中接种1棵所述丛生芽；在温度为25℃±2℃、光照强度为30~60 umol . m^-2. s^-1、光照时间为12~14 h .d^-1的条件下培养30~35天，形成生长健壮的独一味苗；