[发明专利]莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能显著抑制藻类中性脂合成的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及一种能显著抑制莱茵衣藻中性脂含量的油脂代谢基因及其编码蛋白与应用。 

背景技术

进入21世纪，经济飞速发展，人类对石油等化石燃料的消耗日益增加，并且使用化石燃料带来了严重环境污染问题，世界各国都在寻找安全的可再生能源。生物能源可以间接或者直接利用植物或微生物的光合作用，将太阳能固定为化学能，是可再生能源的首选。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作为汽油添加剂进入市场的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且来源广泛，成本低，是最有可能解决石油危机的可再生能源之一。 

生物柴油的制备主要是通过三酰甘油(TAG)与甲醇(乙醇)通过酯交换工艺制成。近年来生物柴油的产量在不断增加，2008年全球生物柴油总量达到1110万吨，预计到2016年生物柴油总产量达到12100万吨，但是生物柴油的价格至今仍是居高不下。原料成本占据了生物柴油总生产成本的60-70％。目前生物柴油的原料有餐饮废弃油、动植物油脂和微藻。利用微藻生产生物柴油具有无可比拟的优势，已成为制备生物柴油的主要途径。 

利用微藻来生产生物柴油有很多工艺步骤，其中优良藻种的选育是关键。最理想的生物柴油生产藻株要求生长迅速、含油量高且脂肪酸组成适宜制备生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻种的分离，藻种含油量的测定，藻种脂肪酸成分的分析以及藻种的大规模培养上。与高等植物相比，微藻的TAG生物合成和积累的分子机制研究还很薄弱，关于TAG代谢网络中相关基因功能研究报告更为稀少。莱茵衣藻是模式单细胞生物，基因组测序已经完成，在缺氮条件下油脂可以积累达到胞质的60％，是研究TAG代谢基因的理想藻株。 

PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是一种细胞质酶，广泛存在于光合生物中，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)和无机磷酸的不可逆反应。在C4植物中PEPC主要起固定CO2作用；而在C3植物和非光合作用组织中，PEPC主要起到回补损失的碳骨架作用。莱茵衣藻中存在两种PEPC酶：PEPC1和PEPC2。前期研究表明PEPC2对微藻的中性脂合成具有负调控作用。日本学者Sugimoto等也发现大豆籽粒中PEPC活性与蛋白质含量密切相关。我国科学家陈锦清等受此启发而提出“底物竞争”假说：大豆籽粒中的油脂和蛋白质之间存在着底物竞争，其共同底物为糖酵解的产物一丙酮酸，PEPC催化和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)进入蛋白质合成途径，而乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)则催化丙酮酸生成乙酰辅酶A进入脂肪酸合成途径，二者的相对活性决定了底物的流向，进而决定蛋白质和脂肪在大豆籽粒中的比例。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制微藻中三酰甘油含量的基因及其编码蛋白与应用。尤其是来自莱茵衣藻的基因。 

本发明所提供的能提高藻类三酰甘油含量的基因名称为CrPEPC1 (Chlamydomonas reinhardti i Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform 1)，该基因在JGI莱茵衣藻基因数据库的名称为estExt_GenewiseW_1.C_280036，位于16号染色体3，641，705-3，648，177区域，含12个外显子。蛋白ID 80312，编码一个名为PEPC1(Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform 1)的蛋白，是根据JGI莱茵衣藻基因数据库上公布的CrPEPC1基因为模板设计特异性引物，扩增cDNA获得全长序列，根据该碱基序列分析而推测编码CrPEPC1蛋白的序列。对其研究发现该基因可以显著降低莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。本发明所述CrPEPC1基因，来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：1DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸； 

3)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 

能降低微藻中性脂含量的基因CrPEPC1的编码蛋白CrPEPC1，是具有序列表中SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。