[发明专利]一种生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶。

背景技术

L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase EC 5.3.1.4)是由微生物产生的、具有变构作用的酶。L-阿拉伯糖异构酶能催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖；由于L-阿拉伯糖和D-半乳糖结构的相似性，故L-阿拉伯糖异构酶也能催化D-半乳糖异构为D-塔格糖。D-塔格糖是甜味剂，具有低能量，降低血糖和抗龋齿等功能。虽然多种微生物具有产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，当前的塔格糖产品仍然是主要来源于化学合成。化学合成D-塔格糖的工序复杂，生产价格高，并且产生大量中间产品污染环境。应用L-阿拉伯糖异构酶将廉价的D-半乳糖异构为D-塔格糖，操作简单，如果有合适的L-阿拉伯糖异构酶那么这一生产方式获得的D-塔格糖将是价格便宜。异构D-半乳糖异构为D-塔格糖的理想反应条件是pH5.0-6.0，＞60℃，并且，反应温度越高，反应速度就越快。前者有利于减少中间副产品的生成，后者有利于D-半乳糖异构为D-塔格糖。虽然多种微生物具有产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，至今目前尚未发现符合最适pH5.0-6.0并且最适温度＞60℃的L-阿拉伯糖异构酶，从而影响了用L-阿拉伯糖异构酶生产D-塔格糖产业的发展。

毕赤酵母(P.pastoris，)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于大规模生产方式，由于毕赤酵母分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。

发明内容

虽然来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 7，最适合温度80℃，但是在80℃和pH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有89％的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；虽然来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 7.5，最适温度80℃，但是，在80℃和pH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有63％的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；虽然来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 5.8，最适合温度55℃，但是在80℃和pH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有32％的它在最适温度和最适pH条件下的酶活性。

从上述可见，在符合工业用途的80℃和pH6的条件下，这三种不同来源的L-阿拉伯糖异构酶都是具有酶活性的，只是酶活性低于最适的温度和最适pH条件的酶活性。但是，在80℃和pH6的条件下上述这三种酶的活力之和显著高于其中的任何单种酶在它的最适温度和最适pH条件下的酶活性。若能增加酶的产量将能弥补它由于偏离最适合反应条件所造成的酶活性的损耗。本发明的目的是为了解决含单种L-阿拉伯糖异构酶基因的菌株生产的L-阿拉伯糖异构酶不能满足当前用L-阿拉伯糖异构酶异构D-半乳糖生产D-塔格糖的需求的问题，构建含嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，生产重组混合嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶，通过增加酶的产量来弥补它们由于偏离最适合反应条件所造成的酶活性的损耗。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆酶基因：应用PCR技术，从嗜热脂肪芽孢杆菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因，从新阿波罗栖热袍菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因，从大肠杆菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因。

2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。

3.构建如附图的毕赤酵母表达载体。