[发明专利]一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测泰乐菌素和替米考星的胶体金试纸条，其特别适于牛奶中泰乐菌素、替米考星残留的检测。

技术背景

泰乐菌素和替米考星属于十六元环大环内酯类抗生素，广泛地用作兽药或饲料添加剂，预防和治疗牛、羊、猪、鸡等动物的感染性疾病，还被加入到饲料中用作生长促进剂。但该类药物随动物性食品进入人体后不仅会产生直接的毒性，还会发生过敏反应及产生耐药细菌。为保护食品安全和人类生命健康，很多国家都对该类药物设置了较低的最高残留限量，如欧盟在1999年禁止将泰乐菌素用作饲料添加剂，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定牛奶中泰乐菌素和替米考星的最高残留限量为50μg/L。因此迫切需要研究一些高灵敏度、快速的方法对该类药物残留进行检测监控。

目前，检测泰乐菌素和替米考星残留的方法主要有微生物法、仪器分析法和免疫化学分析法等。微生物法检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生；仪器分析法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条。

本发明所提供的试纸条包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物；泰乐菌素特异性抗体可为泰乐菌素单克隆抗体或泰乐菌素多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当泰乐菌素特异性抗体为泰乐菌素单克隆抗体时，检测区包被替米考星-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当泰乐菌素特异性抗体为泰乐菌素多克隆抗体时，检测区包被替米考星-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。

所述替米考星-载体蛋白偶联物是由替米考星与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物中的泰乐菌素特异性抗体是以泰乐菌素-载体蛋白作为免疫原制备获得。

所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2）制备具有包被替米考星-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3）将2）制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4）将1）和3）制备好的冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）将泰乐菌素与载体蛋白偶联，制备泰乐菌素-载体蛋白偶联物；将替米考星与载体蛋白偶联，制备替米考星-载体蛋白偶联物；

2）用泰乐菌素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌泰乐菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用泰乐菌素-载体蛋白免疫兔，得到泰乐菌素多克隆抗体；

3）提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；

4）分别将替米考星-载体蛋白和抗抗体包被于反应膜的检测区（T）和质控区（C）；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将制备的泰乐菌素特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物；

7）将泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

8）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

9）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；