[发明专利]一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖饵料培养技术领域，涉及一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类幼体摄食选择性差异的方法，具体是一种基于定量PCR技术，通过定量检测滩涂贝类幼体摄食混合微藻前后贝类体内各微藻组成的变化，来准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异的方法。

背景技术

目前我国“蛤、蚶、蛏”等滩涂贝类产量约为400万吨，占海水贝类养殖总产量近40%。而在滩涂贝类育苗和养殖过程中，微藻饵料的品种和质量直接决定着育苗和养殖的成败。长期实践发现，不同海区不同贝类生长状况明显不同，育苗过程中投喂不同微藻时，贝类生长速度差异很大，说明滩涂贝类对微藻饵料有着明显选择性

也许是研究方法限制，迄今还未见浮游和稚贝阶段贝类对粒度适宜微藻摄食选择性发明研究报道。由于贝类浮游或稚贝阶段幼体太小，无法用传统光学显微镜对胃含物进行解剖观察；颗粒计数仪可观察水体中不同粒度微藻或细菌的适时变化，但实际浑浊水体中，该类仪器无法将各种无机、有机颗粒跟微藻颗粒区分开，更无法区分开粒度接近的微藻。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点，在水产行业已逐渐应用在养殖病害诊断[如中国专利文献数据库中“水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法（CN201010039615.7）”]、水产品检测[Campbell MS and Wright AC.2003.Real-time PCR analysis of Vibrio vulnificus from oysters.Applied and Environmental Microbiology 62:7137-7144.]及养殖水环境实时监测等领域[Tom AM and Auslander M.2005.Transcript and protein environmental biomarkers in fish-a review.Chemosphere 59:155-162.]。报道表明[Barofsky A,Simonelli P，Vidoudez C,et al.,2010.Growth phase of the diatom Skeletonema marinoi influences the metabolic profile of the cells and the selective feeding of the copepod Calanus spp.Journal of Plankton Research 32:263-272.]，该技术在浮游动物饵料摄食的选择性定性定量研究上有着其他技术无法比拟的优势。对微藻而言，其rDNA基因具高保守性，据微藻的rDNA的部分区域设计引物与探针并结合实时荧光定量PCR技术，便可对各微藻进行准确定量分析。本发明应用该技术，可避免传统技术的不足，通过对幼体摄食混合微藻前后贝类体内微藻组成进行实时荧光定量PCR，就可准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异。

发明内容

针对传统技术的不足，本发明提供了一种基于定量PCR技术，通过定量检测滩涂贝类稚贝摄食混合微藻前后贝类体内各微藻组成的变化，来准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异的分析方法。

为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案：一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法，其特征在于：对某种滩涂贝类投喂一定数量的混合微藻，摄食一段时间后对摄食前后滩涂贝类体内的各微藻进行定量PCR分析，根据各微藻在贝类体内的比例确定该滩涂贝类对不同微藻选择性摄食的差异。

本发明所述的滩涂贝类涉及泥蚶、毛蚶、青蛤、缢蛏、彩虹明樱蛤、文蛤等所有滩涂贝类品种。

本发明所述的混合微藻品种可以是目前滩涂贝类苗种培育过程中常用的金藻、角毛藻、扁藻、微绿球藻、骨条藻、小硅藻、三角褐脂藻等，也可以是从天然水域分离出的任何单细胞藻。

本发明所用的饵料微藻均于指数生长期进行投喂，即在接种后经过适宜条件培养4~10天内用于投喂。