[发明专利]一种能快速分解棉秆的复合菌剂及其制备方法

权利要求书

1.一种快速分解棉秆的复合菌剂，其特征在于由菌株保藏编号为ATCC 27405的热纤梭菌、菌株保藏编号为ACCC 00424脱硫肠状菌、菌株保藏编号为CCREMSDMCC120012嗜热地衣芽孢杆菌、菌株保藏编号为DSM 3071溶纤维丁酸弧菌、菌株保藏编号为ACCC 01179枯草芽孢杆菌和菌株保藏编号为ACCC11073嗜热乳杆菌复合成，

热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在复合菌剂中的细胞数含量分别为10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20%。

菌株在复合菌剂中的细胞数含量的含义是指复合菌中各菌株细胞数占复合菌总细胞数的百分含量。

2.根据权利要求1所述的一种快速分解棉秆的复合菌剂，其特征在于热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在复合菌剂中的细胞数含量分别为15%、7%、30%、12%、25%和11%。

3.制备权利要求1所述的一种快速分解棉秆的复合菌剂的方法，其特征在于具体步骤如下：

1）棉秆堆肥的制备

①风干棉杆粉碎成1-1.5 cm的小段；

②将猪粪、牛粪和鸡粪在阴凉通风处晾至含水量为40-60%；

③将畜禽粪便和棉秆混合均匀，混合比例为猪粪：牛粪：鸡：棉杆=1-2:0.5-1.5:0.5-1.5:4-6；堆制，调节堆体起始水分含量在50%～60%，调节起始碳氮比为30；

④堆制前7-60天，每天翻堆1-3次，31-45天时，每4-10天翻堆1次；

⑤堆制过程中每1-3天测定堆体温度、pH值和棉杆分解量指标；

2）棉秆快速分解复合菌系的筛选

①根据堆体的温度、pH和棉杆分解量的测定结果，取堆肥20-30 g加入到500 mL三角瓶中，加200-400 mL已灭菌的生理盐水或0.2M PBS缓冲液置摇床中震荡30min；

PBS缓冲液为用8g NaCl，0.2g KCl，1.44g NaH₂PO₄，0.24g KH₂PO₄，加蒸馏水水至800 mL，用HCl调节pH值至7.0，再加蒸馏水至1000 mL所制备出的缓冲液；

②将三角瓶从摇床中取出静置20-30 min，取上层液体10-20 mL作为接种菌液接种到500 mL盛有250-350 mL培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱50-60℃黑暗静止培养；

所述培养基为改良PCS培养基、Mandels培养基或梭菌增殖培养基；

改良PCS培养基： 含NaCl 5 g， CaCO₃ 2.5 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g， K₂HPO₄ 1 g， MgSO₄·7H₂O 0.35 g，干棉杆1.5-2.5 g、蒸馏水1 L；pH 7.0，经121℃灭菌20 min所得的培养基；

Mandels培养基：含蛋白胨 2.5g，(NH₄)₂SO₄ 1.4g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KH₂PO₄ 2g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄ 1.6mg，ZnCl₂ 1.7mg，CoCl₂ 1.7mg，CaCO₃ 2g，干棉杆 1.5-2.5 g，蒸馏水 1 L，pH  7.0的培养基；

梭菌增殖培养：含胰蛋白胨10.0g，酵母提取物3g，NaCl 5.0g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，醋酸钠3.0g，碳酸钙3g，干棉杆1.5-2.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0的培养基；

③培养过程中每天观测分解现象，并每隔2-3天测定棉秆分解量，即时淘汰分解差或无分解现象的重复，保留分解旺盛的重复，并作为下一次继代培养的菌种，如此循环往复继代培养30-60次，直至分解能力稳定，最终获得稳定复合菌系；

④将分解能力保持稳定的重复，即时用甘油或真空冻干保存；

3）制备棉秆快速分解复合菌剂，载体为棉秆、水稻秸秆和/或小麦秸秆，制作步骤是：

①复合菌发酵：准备混合菌原种和PCS培养液，将相当于培养液体积3-5%的菌种原液接种于PCS培养液中，保温50-60℃静止培养3-5天；

热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20%；

②载体制备：将80℃烘干的棉秆、水稻秸秆或小麦秸秆粉碎后过0.4 mm筛子备用；

③吸附发酵：在棉秆粉中加入占棉秆重量2-3%的尿素、0.1-0.5%的鱼粉、0.1-0.3%的酵母粉和45-55%的自来水，边搅拌边喷洒占棉秆粉1-2%的预发酵好的复合菌液置于发酵缸内于50-60℃保温培养，每天搅拌1-2次，每3-4天喷洒1次同样的菌液，第5次喷洒菌液量为棉秆粉重的10-20%，喷洒后立即60-70℃烘干，当总体水分含量为20-25%时即刻停止干燥，即成制品并包装。

4.根据权利要求3所述的一种制备快速分解棉秆的复合菌剂的方法，其特征在于堆制开始后，前7-10天，每天翻堆2-3次；10-20天，每天翻堆1-2次；20-30天时，每2-3天翻堆1次；31-45天时，每4-6天翻堆1次，46天-60天，每7-10天翻堆一次。