[发明专利]鉴定番茄严重曲叶病毒的引物和探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定番茄严重曲叶病毒的引物和探针及其检测方法，特别涉及一种采用实时荧光PCR的方法鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒（Tomato severe leaf curlvirus，ToSLCV）的引物对、探针及其检测方法。

背景技术

番茄严重曲叶病毒（Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV）是近年发现的病毒新种，属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是番茄上的重要病害，特别是与番茄灼烧病毒（Tomato torrado virus，ToTV）共同侵染，导致许多寄主植物如番茄等的严重减产。ToSLCV是美国的检疫性有害生物，也是蔬菜生产的主要限制因素。这种病毒由粉虱传播，在生长季节，烟粉虱可将病毒传播至很多寄主植物上。

为防止ToSLCV传入美国并扩散，美国农业部动植物检疫局（APHIS）2009年6月1日发布联邦法令，禁止以下来自加拿大以外所有国家的用于种植的寄主植物的进口，包括番茄属（Lycopersicon spp.）、辣椒属（Capsicum spp.）、茄属（Solanum spp.）、藜属（Chenopodium spp.）、蓼属（Polygonum spp.）、滨藜属（Atriplex spp.）、Halogetum属、烟草属（Nicotiana spp.）、独行菜属（Lepidium spp.）、拟漆姑属（Spergularia spp.）、苋属（Amaranthus spp.）及锦葵属（Malva spp.），直到风险评估完成并制定有效的缓解措施。

目前该病毒主要分布于洪都拉斯、墨西哥、危地马拉及尼加拉瓜。ToSLCV可经介体传播，一旦田间有植株发病，病毒将快速扩散，往往在短时间内就会导致番茄大面积发病，导致严重的经济损失。我国质检总局也发布番茄严重曲叶病毒疫情警示，要求对上述寄主植物在入境时加强检疫，避免该病毒的传入。然而，我国目前还没有关于该病毒的研究，更没有相关的检测方法，因而有必要建立该病毒的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供鉴定番茄严重曲叶病毒的组合物、试剂盒及其检测方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒（Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV）的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列为序列表中序列3。

其中，序列1有26个核苷酸组成；序列2由23个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

所述报告荧光基团可为Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Joe(JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述淬灭荧光基团可为Tamra（TAMRA）、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)、Bhq1(BHQ1)或Bhq2(BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。

鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒（Tomato severe leafcurl virus，ToSLCV）的引物对和探针也分别属于本发明的保护范围。

所述引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列具体为序列表中序列3。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。

上述组合物或引物对或探针在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒（Tomato severe leafcurl virus，ToSLCV）的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。