[发明专利]诱导性表达多能性维持基因的有蹄类动物细胞系及其构建

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域；更具体地，本发明涉及诱导性表达多能性维持基因的有蹄类动物细胞系及其构建。

背景技术

猪是一种常见的家畜，在免疫学和生理学上与人类有很大的相似性。猪的器官在解剖结构和生理生化特性方面与人类很相近，其大小也类似于人的器官，且发生人猪共患疾病的可能性很小。所以，猪是目前异种器官移植的首选器官供体动物。猪的平均寿命为20年，较长的生命周期也为特定研究创造了有利条件。因此，长期以来，猪在各种疾病及新药安全性评价等生物医药研究的众多领域中都是非常有用的实验动物。

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞具有无限增殖、自我更新的能力，能够在体外培养的环境中永久传代，并保持正常核型；胚胎干细胞还具有“全能性”，无论在体内还是体外环境，它们都能分化成成体生物所有的细胞类型。

目前有蹄类动物传统的基因改造方法主要有两种。非定点转基因是随机插入，外源基因表达的可控性比较差，常常产生基因沉默，表达量低等问题，同时外源基因可能破坏宿主基因的正常表达，将影响到宿主的发育和存活。体细胞定点转基因技术是将体细胞基因打靶与核移植(克隆动物)结合起来，它的问题是，首先在体细胞中进行同源重组非常的困难。而对于胚胎干细胞系来说，基因修饰是非常成熟的，胚胎干细胞是转基因动物进行定点基因修饰的最佳细胞材料，这已在模式生物小鼠上得到了充分的论证。除此，ESCs还能够嵌合到早期胚胎，从而使嵌合胚胎的子代动物的各种组织和器官中都包含了来源于两种不同基因背景的细胞。基于胚胎干细胞的上述特点，建立和利用大型动物的胚胎干细胞对于探讨人类的发生发育机制，药物筛选，以及再生医学有极其重要的意义。因此，建立猪的胚胎干细胞系具有极其重要的意义。除了可以大幅度提高克隆猪的效率外，还可以利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，从而达到基因定点整合或敲除，可以较高效率地生产出高质量的转基因猪。

到目前为止，建立了真正意义上的胚胎干细胞系的物种只有小鼠，人，恒河猴和大鼠。科学家虽然经过了长期的不懈努力，仍然未能建立起真正的猪以及其他有蹄类动物的胚胎干细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供诱导性表达多能性维持基因的有蹄类动物细胞系及其构建。

在本发明的第一方面，提供一种在有蹄类动物成纤维细胞中表达oct4基因的方法，包括：

(1)提供慢病毒质粒1，其中含有以下操作性连接的元件(5’→3’)：ef1α，rtta，IRES，EGFP(其中ef1α为启动子起始rtta和eGFP的转录，eGFP由IRES独立起始蛋白的翻译过程，rtta和eGFP具有相同的启动子ef1α，但是具有独立的终止子)；以及慢病毒质粒2，其中含有以下操作性连接的元件(5’→3’)：ef1α，EGFP，TRE，Oct4(其中eGFP的启动子为ef1α，oct4的启动子为TRE，但是TRE需要在DOX存在的情况下通过和rtta结合后起始oct4的表达，eGFP和oct4有各自独立的终止子)；

(2)将慢病毒质粒1和慢病毒质粒2共同转染有蹄类动物成纤维细胞，选择EGFP阳性的细胞，该细胞是能表达oct4基因的有蹄类动物成纤维细胞。

在一个优选例中，所述的方法还包括步骤：

(3)利用强力霉素(doxycycline，Dox)处理步骤(2)获得的有蹄类动物成纤维细胞，诱导有蹄类动物成纤维细胞表达oct4基因。

在另一优选例中，强力霉素的用量是0.5-6ug/mL；较佳地为1-4ug/mL。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(4)从步骤(3)获得的EGFP阳性细胞中，选择oct4基因高表达的有蹄类动物成纤维细胞。

在另一优选例中，利用聚合酶链反应来确定所述的有蹄类动物成纤维细胞的oct4基因表达量。

在另一优选例中，所述的慢病毒质粒1和慢病毒质粒2以(1～2)∶(1～2)混合。

在另一优选例中，所述的慢病毒质粒1和慢病毒质粒2以MOI(感染复数)1.5-3(较佳地为2)感染有蹄类动物成纤维细胞。

在另一优选例中，所述的有蹄类动物是猪。

在本发明的另一方面，提供一种可诱导表达oct4基因的有蹄类动物成纤维细胞，所述的细胞中转染有慢病毒质粒1，其中含有以下操作性连接的元件(5’→3’)：ef1α，rtta，IRES，EGFP；以及慢病毒质粒2，其中含有以下操作性连接的元件(5’→3’)：ef1α，EGFP，TRE，Oct4。