[发明专利]一种快速双向多位点基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种快速高效的基因突变方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的特异性引物，通过两轮PCR 扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。

背景技术

随着分子生物学研究的不断发展，基因定点突变技术成为一种常用的改造和优化基因的方法，在基因合成，基因表达及蛋白质结构与功能之间的关系等方面的研究中得到广泛的应用。PCR介导的点突变是使用最为普遍的基因定点突变技术。PCR诱导定点突变包括重叠延伸突变及一步快速突变等，具有准确、高效的特点，其中重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置实现定点突变，但耗时长且突变位点有限。本发明对传统重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，可以在同管内实现双向多位点快速基因突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因多位点突变方法，采用此方法可以快速、准确地实现双向多位点基因突变和新目的基因片段合成。

所述快速双向多位点基因突变方法包括以下步骤：

1）  根据目的基因待突变位点及其上下游序列特点，确定上中下三个DNA片段，根据上述三个DNA片段的序列特点和待突变位点，设计三对特异性引物，分别表示为F1F和F1RT，F2FT和F2RT，以及F3FT和F3R，其中Fi（i=1，2和3）表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物，T表示延伸序列；

2）  进行第一轮PCR，以目的基因为模板，利用步骤1）中的三对特异性引物分别扩增得F1，F2 和F3 三个DNA片段；

3）  进行第二轮PCR，分离纯化步骤2）所得的扩增产物F1，F2 和F3，并将其作为扩增模板，采用重叠延伸PCR 方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接，以F1F和F3R为引物进行扩增，即可扩增得到双向多位点突变的基因产物；

4）  在步骤1）中，F1片段的下游引物F1RT和F2片段的上游引物F2FT含有相同待突变片段和部分重叠序列，F2片段的下游引物F2RT和F3片段的上游引物F3FT亦含有相同待突变片段和部分重叠序列；

5）  在步骤2）中，第一轮PCR扩增产物F1片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列。

附图说明

图1 基因双向多位点突变原理示意图。以目的基因为模板，利用三对引物进行第一轮PCR扩增，得F1、F2和F3三个片段；再以上述三个DNA片段为模版，以F1F和F3R为引物进行第二轮PCR扩增，即获得双向多位点突变基因。

图2 PCR产物电泳图。图A、B分别为第一、二轮PCR扩增产物的电泳图。

具体实施方式

实施例1：长度为324 bp, 含有两个突变DNA 片段的获得

一、引物的设计

根据所选DNA 片段（见序列表SEQ ID No. 1）的拟突变位点及其序列特征，设计三对特异性引物，分别用于扩增选定的DNA片段和其相邻上下游片段（F1：上游片段，F2：靶序列，F3：下游片段）。所设计的引物序列如表1所示，其中划线部分为延伸序列，即重叠部分。

表1 引物序列