[发明专利]基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组融合蛋白，特别是碱性成纤维细胞生长因子与胶原蛋白融合蛋白。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），是成纤维生长因子家族中的一员，最初是从牛脑垂体中提取得到的，因其能促进成纤维细胞增殖，且等电点为9.6，故将其称之为碱性成纤维细胞生长因子。碱性成纤维细胞生长因子由155个氨基酸组成，分子量约为18kD，对热不稳定，易被蛋白酶降解，它广泛存在于来源于中胚层及神经外胚层的细胞及多种肿瘤细胞中，是一种能促进中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子。在生物进化上，碱性成纤维细胞生长因子具有很强的保守性，人和牛的碱性成纤维细胞生长因子只有两个氨基酸不同，其氨基酸同源性高达98.7%。

碱性成纤维细胞生长因子的活性半衰期只有几个小时，在体内作用的发挥，需持续长时间与靶细胞上的高亲和力受体结合。成纤维细胞生长因子受体是一类具有自主性磷酸化活性的跨膜糖基化受体，碱性成纤维细胞生长因子与之结合后激活受体细胞内酪氨酸激酶活性区，从而引起一系列信号传递。碱性成纤维细胞生长因子发挥作用还离不开低亲和力受体，即硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的辅助，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖具有促进碱性成纤维细胞生长因子与成纤维细胞生长因子受体结合、增强碱性成纤维细胞生长因子稳定性、调节碱性成纤维细胞生长因子活性等生物学作用。

碱性成纤维细胞生长因子是一种具有广泛生物活性的生长因子，实验证实，碱性成纤维细胞生长因子能有效促进新生血管的形成如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生和胶原的合成等；能通过趋化作用和促细胞迁移作用引导巨噬细胞、间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，启动创伤愈合过程，从而促进软组织损伤的修复；能促进软骨细胞产生硫酸软骨蛋白聚糖、Ⅱ型胶原，使其维持分化形态，从而促进骨组织损伤的修复；也能促进神经轴突生长，延长神经细胞的存活期，营养神经，从而修复神经组织损伤；还能促进肢体再生。体内实验证明，碱性成纤维细胞生长因子对去神经支配的两栖动物类肢体再生胚基有促进作用。近些年来，重组碱性成纤维细胞生长因子还被广泛应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病，但表达量普遍低下而使其生产成本相对较高。

胶原蛋白（collagen）是体内含量最多的一种蛋白质，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。另外，胶原蛋白具有良好的细胞粘附性，与细胞结合对细胞迁移、胶原分解代谢以及血小板凝聚具有一定的作用。鉴于胶原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性以及促细胞形成等诸多功能，在生物医用材料、组织工程、化妆品等领域具有广泛的应用价值。碱性成纤维细胞生长因子作为一种临床上治疗各种创伤、烧烫伤、溃疡等的有效药物，与胶原蛋白结合制成的新型生物活性材料，具有快速止血、加速创面愈合和促进组织修复等功能，其在重度渗血创面的止血愈合、妇科宫颈糜烂的治疗及牙周组织再生等临床试验中取得显著效果。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用途广、使用效果好的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法。

本发明还要解决的还有一个技术问题在于为基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白提供一种新用途。

解决上述技术问题采用的技术方案是：该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下：

1   GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA

61  GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ

121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER

181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP