[发明专利]鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程领域，特别是涉及一种鸭瘟病毒转移载体及其应用。 

背景技术

利用基因工程技术，将外源DNA转移到相应载体中，通过和病毒基因重组，可以使病毒基因功能丧失，或者表达外源蛋白。通过这种方式，一方面，可以更清楚地了解缺失基因的功能，另一方面，利用病毒表达外源DNA蛋白，可将病毒发展成为一种活载体疫苗。病毒活载体疫苗的转染效率高，表达的保护性外源蛋白接近翻译后水平的成熟蛋白；这种疫苗可同时启动机体细胞和体液免疫，可通过一次免疫预防多种疾病，疫苗用量少，既降低了生产成本，又简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗间的干扰现象，因此，病毒活载体疫苗成为了疫苗研究的一个重要方向。 

随着分子生物学的发展，对一些基因组较大病毒的分子位点和结构的认识逐渐清晰，从而将它们发展成为有效的重组病毒活疫苗。在禽病疫苗研究中，鸡痘病毒，腺病毒及包括火鸡疱疹病毒、鸡传染性喉气管炎和鸡马立克氏病病毒在内的疱疹病毒。其中，禽疱疹病毒具有宿主范围窄、外源基因容量大，病毒滴度高的特点，随着对它们基因组的了解，近年来被广泛研究。 

我国是世界最大的鸭、鹅等水禽生产和消费国，以龙头企业为代表的规模化养殖在不断发展，但是，传染病的危害仍然是影响水禽养殖业健康、可持续发展的重要因素，因此，亟待加强对水禽传染病的防治。 

鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭、鹅及多种雁形目水禽的急性接触性传染病，1923年由Baudet首次在荷兰报道该病，之后在法国、美国、印度、比利时、英国、泰国、加拿大等国家流行。我国于1957年首次发现并报道，随后在华南、华中和华东等养鸭业较发达 的地方发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。在我国，鸭瘟曾被列为一类动物传染病，目前仍被列为二类动物传染病。 

目前，鸭瘟病毒的基因组结构已经比较清楚。NCBI上登录了鸭瘟病毒强毒株CHv(登录号：JQ647509)、欧洲株2085(登录号：JF999965)和疫苗株VAC株(登录号：NC_013036)全基因组，疫苗株Clone-03所有的ORF也已经全部上传。鸭瘟病毒的基因组为158-160kb的线状、双链DNA，基因组类型为D型，由UL和US及US两侧的重复区域IRS和TRS组成，共包括78个编码基因。与其他疱疹病毒一样，基因组庞大的鸭瘟病毒，也可以发展成为有效的病毒活载体疫苗。鸭瘟病毒的感染宿主为鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽，因此，鸭瘟病毒载体对其他动物和人类是安全的，但可以在防治水禽相关疾病中发挥重要作用。 

糖蛋白既是动物机体免疫系统识别的成分，也是病毒感染时细胞与病毒相互作用的重要因子，其基因结构和功能一直是疱疹病毒研究的热点之一。鸭瘟病毒可编码12种糖蛋白，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM和gN。在其它疱疹病毒，体外复制非必需的糖蛋白gC、gE、gG、gI和gM常常被用作外源基因的插入位点。但是，鸭瘟病毒的相关研究仍处于起步阶段，各种糖蛋白的功能仍待进一步研究。 

发明内容

本发明的目的在于：1)提供一种重组鸭瘟病毒的转移载体及其构建方法；2)研究开发我国适于水禽免疫的可复制性病毒活载体，研制相关基因工程疫苗，以期在控制水禽重要传染病方面发挥作用，3)为鸭瘟病毒基因功能研究提供参考。 

鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。 

所述的转移载体pUC-ΔgC-EGFP的制备方法，由以下步骤完成： 

1)用Xho I和BamH I双酶切pEGFP-C1，末端补平后，平末端连结，再通过PCR方法扩增出包含CMV启动子、EGFP和SV40polyA的片段共1315bp片段，克隆进载体 pMD19-T，构建pMD-EGFP，其中含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒； 

2)以鸭瘟病毒CHv株为材料，通过PCR方法将UL44基因的左端1178bp片段和右侧1421bp片段扩增出来，克隆进载体pMD19-T，构建质粒pMD-gCL和pMD-gCR，分别包含UL44基因的左侧1178bp片段和右侧142Ibp片段。