[发明专利]一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于化合物分离纯化技术领域，涉及一种微生物来源的真菌漆酶诱导活性化合物的发酵制备、高纯度漆酶诱导活性化合物的纯化工艺及其在真菌漆酶诱导方面的应用。 

背景技术

漆酶（Laccase, EC 1.10.3.2）是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值（Arora DS, Sharma RK (2010) Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications. Appl Biochem Biotechnol 160:1760–1788），近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。 

漆酶广泛存在于高等真菌（特别是担子菌）中。多数真菌分泌的天然漆酶存在产量低、发酵周期长、后处理繁琐等缺点，无法满足工业化应用的需要。目前，用来提高漆酶的生物合成产量主要有两种方法：重组表达和添加化合物诱导。然而，重组表达产量依然较低、且生产成本高、后处理难度大，使漆酶生产的成本大大提高，限制了漆酶在工业生产中的应用；有效的诱导剂多为芳香类化合物或重金属离子，其有环境毒性并且价格昂贵，有效作用浓度大，通常在10^-3~10^-2摩尔级别，易造成环境污染，生产后的发酵液需要脱毒处理，提高了生产成本，同样无法突破漆酶产业化应用的瓶颈。因此，寻找一种清洁、高效的漆酶生产方式是推进漆酶产业化进程的迫切需要。 

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种高效真菌漆酶诱导活性化合物（名称为3-羟基-2-辛基-戊二酸）的发酵制备和分离纯化工艺及其在真菌漆酶诱导发酵方面的应用。 

本发明的目的之一是提供一种对真菌漆酶具有高诱导活性的化合物，该化合物有如下分子式： 

本发明的的另一目的是保护该活性化合物在诱导真菌漆酶合成方面的应用。 

本发明的活性的化合物来源于微生物发酵菌株Gongronella sp，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武昌区八一路武汉大学； 保藏日期：2012年3月27日；保藏号为：CCTCCAF 2012004。 

该活性化合物的发酵制备方法，是将上述发酵菌株，经发酵培养获得发酵液，然后再发酵液经分离纯化后获得纯活性化合物。 

所述发酵培养是指将Gongronella sp.接种在经灭菌的pH4.0~7.0的发酵培养基中，于温度25~31^oC、摇床转速100~150rpm条件下培养3~7天后通过纱布过滤收集发酵液备用；所述的发酵培养基为每升水中含10~20g蔗糖、1~2g DL-天冬酰胺、0.7~1.5g KH₂PO₄、0.2~0.6g MgSO₄·7H₂O、0.02~0.15g Na₂PO₄·7H₂O、0.01~0.05g CaCl₂、0.01~0.05g FeSO₄·7H₂O、0.01~0.04g 腺嘌呤、20~60μg VB₁。 

作为优先，所述的发酵培养基为每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.1g Na₂PO₄·7H₂O、0.01g CaCl₂、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.0275g腺嘌呤、50μg VB₁。 

所述分离纯化依次包括以下步骤： 

(1) 制备的发酵液通过萃取剂1:1（v/v）萃取，萃取液在100~2000Pa，30~55^oC的条件下减压蒸馏，去除萃取剂，得到活性化合物粗制品；所述萃取剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一种；