[发明专利]利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物育种及其发酵技术领域，涉及一株利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌。 

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA 循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一 

相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为 酸成为近年来研究的热点。

发酵产丁二酸菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，因多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产丁二酸放线杆菌( Actinobacillus succinogenes )，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutam icum ) 和大肠杆菌( Escherichia coli)等。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。 

提高丁二酸的发酵产酸能力有很多的方法，尤其在发酵调控的手段上，很多的科研工作者都进行了深入的研究。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段是菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。由于两阶段发酵的局限性以及复杂性，使得一步厌氧发酵产丁二酸的研究受到越来越多的关注。然而纯厌氧条件下，大肠杆菌利用合成培养基生长并积累丁二酸的研究却鲜有报道。可见，通过改良菌株，使其可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长并大量积累产酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一株能够在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长的大肠杆菌，使其可以积累丁二酸。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。 

一、一株利用合成培养基纯厌氧发酵产丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BER108，其保藏号编号为：CCTCC NO：M 2012068。 

二、本发明所述的利用合成培养基纯厌氧发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌Escherichia coli BER108的筛选方法，将大肠杆菌的出发菌株E.coliAFP111经等离子体诱变后，利用合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株，在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产产丁二酸的菌株为目标菌株。其具体步骤如下： 

1）等离子诱变：将大肠杆菌原始菌株E.coliAFP111在试管中活化，37℃，200r/min，过夜培养；得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD₆₀₀=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80 ~120W为射频功率，以10 ~30SLM作为气体流量，以10~30s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变。

2）合成培养基平板初筛：将诱变后的载片置于装有1mL 的生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24h；挑选生长较大，较为饱满的菌落。 

3）合成培养基平板复筛：将步骤2）中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养，37℃厌氧培养24h，挑选生长较大，较为饱满的菌落。