[发明专利]一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗

说明书

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗。

背景技术

狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。由于狂犬病尚无有效的治疗手段，发病死亡率极高，因此，疫苗的预防接种是防止狂犬病发生、保证人民健康的唯一有效手段。

人二倍体细胞（Human Diploid Cell，HDC）狂犬病疫苗是将狂犬病病毒固定毒株在人二倍体细胞上适应、传代增殖、浓缩、纯化而来。因为所用细胞来源于人类，具有副反应小、免疫起效时间短、抗体滴度高等优点，尤其对狂犬病这种高致死性疾病，能够使个体尽快获得保护性抗体是至关重要的。

HDCV的缺点在于HDC不太容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格比较昂贵。在美国，用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元，这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。由于狂犬病疫苗的特殊性和复杂性，制备该疫苗具有相当的难度，特别是在分离和纯化方面。

另外，在狂犬咬伤后通常需要注射大量的破伤风抗毒素，用于预防破伤风梭状芽孢杆菌的感染，这就造成用药的不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时预防狂犬病和破伤风的疫苗。

本发明的技术方案为：一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其由狂犬疫苗和破伤风类毒素组成，所述狂犬疫苗由人用二倍体细胞WI-38接种CDKHBP-1毒株纯化得到。

进一步地，所述破伤风类毒素的量为5～9LF/剂。

进一步地，破伤风类毒素可采用任何现有工艺制备，所述狂犬疫苗由以下方法制得：

1) 人二倍体细胞WI-38的复苏、培养及扩增；

2) 在人二倍体细胞WI-38上接种CDKHBP-1毒株；

3) 收获病毒液，灭活、浓缩；

4) 纯化；

进一步地 ，所述纯化包括以下步骤：

1）超滤纯化；

2）蔗糖密度区带离心；

3）Sepharose4FF柱层析纯化；

4）加入纳米氢氧化铝佐剂吸附，加保护剂人血白蛋白。

本工艺使用的人二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心，先建立人二倍体细胞种子库和工作库，并对细胞库细胞进行系统的鉴定，在制备疫苗前，先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞培养液，所述的培养液可以选择199培养液、平衡盐培养液，其中优选199培养液，细胞培养液中含2～10%的牛血清和卡那霉素或庆大霉素26～30U/ml，pH7.0～7.5，其培养温度为35～37℃，培养方式为转瓶培养、细胞工厂培养或微载体反应器培养。

培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1:2～1:4当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬病病毒，细胞维持液中最好加入0.3～0.5%（W/W）的人血白蛋白，同时调整pH7.0～7.5，培养温度35～37℃，并可加入抗生素适量，可使用的培养液包括199液、平衡盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株CDKHBP-1毒株0.1～0.01mol及上述细胞维持液，培养66～79小时，即可收获病毒液。

狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是3～5天收获一次，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8.0LgLD50/ml。

本工艺在人二倍体细胞上接种的狂犬病毒为在传代的人二倍体细胞狂犬病毒，实验结果显示，狂犬病毒在人二倍体细胞上能很好生长繁殖，在人二倍体细胞上传代狂犬病毒10代以内很稳定，10代以上的毒株免疫原性则有明显下降。即接种人二倍体细胞上的狂犬病毒最好是10代以内的。

收获的病毒液用?-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗，本工艺选用超滤浓缩的方法对粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万～30万的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上，然后纯化疫苗。

所述纯化包括以下步骤：病毒液先经超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过蔗糖密度区带离心，然后经过Sepharose4FF柱层析。