[发明专利]红缘拟层孔菌发酵产物的抗肿瘤和增强免疫活性

说明书

技术领域：

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的抗肿瘤和免疫增强活性，并提供其发酵制备方法及条件，研究表明红缘拟层孔菌发酵菌丝体对肝癌H₂₂荷瘤具有较好的抑制作用，且能明显的增强小鼠的免疫活性。该研究属于菌物生药发酵产物的制备及其在医药与保健品领域的应用方法，并为预防及治疗肿瘤药开发提供依据。

背景技术：

癌症，医学术语又称恶性肿瘤，是控制细胞生长增殖机制的失常而引起的疾病，是目前危害人类健康和生命的重要疾病之一。近些年来肿瘤的发病率在不断上升，已经成为人类的头号杀手。

随着天然产物化学的发展，真菌作为自然界中的一大生物类群，以其药理活性好，副作用较小，并且并可通过发酵手段大量获得，越来越被人们所重视。多孔菌科真菌是担子菌中的一大类群，例如中药灵芝、猪苓、茯苓等都属于这一类群，多孔菌类的抗肿瘤活性也多有研究报道，被称为桑黄的菌类以及灵芝和桦褐孔菌的抗肿瘤活性都很好，因此研究真菌中抗肿瘤成分并将其开发成药品或保健品的需求是十分迫切的。

红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola (Sw.:Fr.)P. Karst.，又名“红缘层孔菌”等。隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科(Polyporaceae)，拟层孔菌属(Fomes)。红缘拟层孔菌是世界性分布的木腐性真菌，它大多生长在阔叶树活立木、针叶树、腐朽木以及倒木上，对很多种类的阔叶树木具有很强的危害性。红缘拟层孔菌具祛风除湿，强心，解热，滋补强壮，扶正培本、补肺益肾，安神定志、和胃健脾等作用，对癌症、心脏病、脑溢血、贫血、糖尿病、肾炎和支气管炎等疾病有很好的治疗效果。民间用其治疗矿工的“寒腿”病。在中国东北长白山地区为常见种类，在春季、夏季和秋季均会出现。味微苦、性平。有研究表明，红缘拟层孔菌提取物具有抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抑制肥胖、保护肝脏、抑制水肿并能清除游离基、调节中枢神经系统、治疗糖尿病、增强人体免疫力。

发明内容：

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的制备方法，具体如下：

（1）最适基础培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，维生素B1 0.4g/L。

（2）各级种子的制备：用接种环将红缘拟层孔菌母种斜面培养基上的菌丝接在两个500ml摇瓶内，每个摇瓶装有筛选出的最佳培养基100ml，置于28℃的恒温振荡器中，转速130r/min，PH自然，发酵周期为80小时，作为一级液种。将这200ml一级液种分成四等份后转接入四瓶2000ml摇瓶中，每瓶装有200ml培养液，同一级液种的培养条件培养64小时作为二级液种。

（3）升罐培养实验：将35L筛选出的最佳培养基装入50L的发酵罐中，在121℃条件下对发酵罐内的培养基进行灭菌25min后将培养好的红缘拟层孔菌的二级液种在火焰下转接入50L发酵罐中，在28℃的条件下培养96小时，初始搅拌数为150rpm，罐压0.05Mpa，起始溶氧为100％，通气量1：0.5，PH自然。最佳发酵周期为56~64h，在此条件下菌丝体湿重达到6.8901g/L，胞外粗多糖含量达到0.2965g/L。

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的小鼠抗肿瘤活性的研究，方法与结果如下：

无菌条件下，取接种7d的种鼠腹水肝癌H₂₂细胞，用生理盐水制成细胞个数为1×10⁶-5×10⁶/mL的细胞悬液，以每鼠0.1mL接种于小鼠左后肢腋窝皮下，随机分组，每组10只。次日开始给药，阳性药组隔天腹腔注射环磷酰胺（25mg/kg），体积为0.2mL/10g，受试药组（100mg/kg，200mg/kg）和对照组（生理盐水）灌胃给药，体积为0.2mL/10g，连续10d，第11天处死小鼠，摘取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重。肿瘤抑制率=（对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。胸腺指数为每g体重中胸腺的mg数，脾指数为每g体重中脾脏的mg数，各数值均以平均值±标准差（）来表示。通过软件spss 18.0统计分析数据的代表性，p<0.05说明在统计学上差异显著，p<0.01说明在统计学上差异极显著。