[发明专利]阴道毛滴虫和白色念珠菌双通道荧光PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的分子生物学检测方法，特别是涉及阴道毛滴虫、白色念珠菌的双重检测。

背景技术

毛滴虫是一种有鞭毛的原虫，目前发现寄生在人体的毛滴虫有3种，即口腔毛滴虫、人毛滴虫和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis,TV）。前两种在人类病因学上无意义，而TV寄生在阴道、尿道或膀胱，能引起人的泌尿生殖道疾病，称为滴虫病。滴虫病分为滴虫性尿道炎、滴虫性阴道炎、滴虫性前列腺炎。阴道毛滴虫引起的女性阴道炎，以泡沫状阴道分泌物为典型表现。有人报道，阴道毛滴虫能吞噬精子，导致不孕，还能引起细胞发育异常及细胞核异常，因此，有滴虫女性的癌症发生率显著高于无滴虫女性。女性患者滴虫病的症状涵盖从阴道穹窿及子宫颈轻度充血到广泛糜烂、瘀点及肛周糜烂、颗粒状易碎及潮红的子宫内膜（草莓状子宫颈）。男性患者症状轻微，有时表现为慢性前列腺炎的症状。滴虫病与某些其他性传播疾病的症状类似，故单纯以临床症状难以做出确诊，需用实验方法检出阴道毛滴虫方可确诊。TV感染是一种十分常见的性传播疾病,该病呈全球分布,人群普遍易感。传染源是滴虫患者和滴虫携带者，主要通过性交直接传染，亦可通过被污染的毛巾、公共浴池、游泳池、坐式马桶、浴缸等物品等间接传播。世界卫生组织将阴道毛滴虫病作为性传播疾病。据WHO报道,全球每年有1.7亿人感染TV。除引起泌尿生殖道感染外，TV还是HIV感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。女性妊娠中期感染TV常引起胎膜早破、早产、低体重儿等,它也是男性非淋菌性尿道炎的一个重要病因。

念珠菌是一种内源性真菌，它可以侵犯皮肤、粘膜和内脏，表现为急性、亚急性和慢性炎症。目前发现对人体致病的念珠菌有七种，其中以白色念珠菌（Canidia Albicans，CA）在临床上最为常见，其毒力也最强。人生殖器官皮肤粘膜的念珠菌感染称为生殖器念珠菌病。白色念珠菌可引起女性的外阴及阴道炎症，主要表现为外阴及阴道瘙痒及阴道分泌物增多并呈豆渣样白带，阴道壁粘膜红肿，有灼烧感。可通过性交传染给男性，引发男性的念珠菌性龟头炎和包皮龟头炎，表现为包皮和龟头轻度潮红，龟头部有红丘疹，包皮垢异常增多，呈白色乳酪状。白色念珠菌阴道炎的危害极大：可能会造成暂时性不孕，如果患了念珠菌性阴道炎，阴道的酸碱度的改变会使精子的活动力受到抑制，且炎性细胞可吞噬精子，并使精子活动力减弱；可影响胎儿发育，极少数孕妇阴道中的念珠菌能经宫颈上行，穿透胎膜感染胎儿，引起早产。另外经阴道分娩时，也可能感染引起口腔念珠菌病——鹅口疮。有些婴儿还可能出现肛门周围念珠菌性皮炎；引起其他疾病，若念珠菌性阴道炎长期不治疗的话，易造成炎症上行，引起宫颈炎和宫颈糜烂，如果病原体进入子宫腔，则会引起输卵管卵巢炎症、盆腔炎等，最终影响怀孕。

与其他性传播疾病一样,这两种病菌引起的临床症状不典型,临床确诊常借助实验检测。常用的方法有：培养法（诊断“金标准”）、涂片染色法、悬滴法、免疫学方法及核酸检测法等。这些方法在准确性、可靠性、易用性等一个或多个方面有缺点。例如，涂片染色法阳性率低，培养法耗时需要3-7天，且不够敏感。因此，如何选择准确、可靠、方便的实验诊断方法颇为重要,合适的方法能有效减少该病带来的危害。

发明内容

本发明的第一方面提供了用于在一个反应管中同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行实时荧光PCR检测的引物和Taqman探针。

在一个实施方案中，对于阴道毛滴虫检测，其上游引物序列为SEQID NO：1或13的核苷酸序列，下游引物序列为SEQ ID NO：2或14的核苷酸序列，TaqMan探针为SEQ ID NO：3或12的核苷酸序列；对于白色念珠菌检测，上游引物序列为SEQ ID NO:4的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO：5的核苷酸序列，TaqMan探针为SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

在一个实施方案中，上述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团（R），并且3’端标记有荧光淬灭基团（Q）。

在一个实施方案中，上述阴道毛滴虫TaqMan探针（SEQ ID NO：3或12）5’端的报告荧光基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为BHQ₂。在一个实施方案中，白色念球菌TaqMan探针（SEQ ID NO：6）5’端的报告荧光基团为HEX，3’端的荧光淬灭基团为BHQ₂。