[发明专利]一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工领域，更具体地，本发明涉及一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，简称SAM)为生物体代谢中最重要的甲基供体，除了起着转甲基作用之外，还具有转硫和转氨丙基作用，分别参与同型半胱氨酸(SAH)、谷胱甘肽(GSH)等重要的抗氧化活性物质和多胺的代谢。临床上SAM具有很高的药用价值，被用于在肝病、抑郁症等神经系统疾病、关节炎和纤维性肌痛等疾病的治疗。80年代中期，SAM在欧洲首先被推荐为抗忧郁症的精神病药物。1990年在美国也通过了FDA的随机双盲法验证。由于现有生产工艺的制约，SAM生产成本与价格相对较为昂贵。高效与成本低廉的SAM生产工艺与方法的研究具有重要意义。

SAM是由Cantoni于1951年发现的一种广泛存在于生物体内的含硫化合物，其分子式为C₁₅H₂₂N₆O₅S，分子量为399，结构式如下。

生物体内的SAM来源主要是由在含有Mg²⁺和K⁺条件下由SAM合成酶催化L-甲硫氨酸和ATP合成的。

SAM的规模化生产则经历了化学合成法、酶促转化法和微生物合成法的过程。其中化学合成法产率较低，产物构型较为复杂，酶促转化法则受制于获取大量且高活性的SAM合成酶的难度与成本控制，利用微生物合成与制备SAM的方法成为产业化研究的重要方向。

现在微生物合成法主要是通过酵母菌进行合成，方法是在培养酵母过程中添加SAM的前体甲硫氨酸，利用酵母能在胞内积累SAM的特性，采用化学、法式压榨、高压匀浆或者热处理的方式破壁，然后使用热水抽提、高氯酸抽提、三氯酸抽提，最后再使用色谱层析、选择性沉淀剂(如苦味酸、Reinack盐、硼酸等)等分离提取SAM。该方法的缺点在于产生的SAM储存于酵母细胞内，必须经过细胞破碎后再经纯化后获得，工艺过程尤其是纯化较为复杂。如果能够实现微生物菌株产生的SAM分泌到细胞外的培养基上清中，则可以显著提高SAM的生产效率，显著简化纯化的过程与提高纯化效率。

生物技术研究的不断进步尤其是合成生物学研究的飞速发展，促使人们不断尝试通过对微生物进行有针对性的改造，使微生物成为生产特定目标产物的细胞工厂。在专利CN 1570126A中，苏珊·莱昂哈特斯伯格和托马斯·迈尔以大肠杆菌为宿主过量表达大鼠肝脏合成酶基因，发现改造的工程菌株能把SAM分泌到培养基中，与之前使用的酵母菌宿主相比，简化了工艺流程。在专利CN185303A中托马斯·施勒塞尔等除了在大肠杆菌中过量表达大鼠肝脏合成酶基因以外，还发现cmr(mdfA)基因能够促进大肠杆菌把SAM分泌到培养基中，这一实验结果提示可以通过提高SAM的分泌转移途径的效率，有效提高SAM的产量。然而由于cmr(mdfA)基因是多药耐药基因，利用cmr改造后的大肠杆菌可能存在潜在生物安全性问题。

从70年代开始，对不同生物体内如酿酒酵母，大鼠(肝脏)，普氏立克次氏体，非洲锥虫SAM的转运就开始了研究，不过只是提出了存在SAM转运蛋白的假说，并没有对SAM转运蛋白进行鉴定。直到2003-2006年，人们陆续发现在酵母、人类、拟南芥、大鼠、果蝇等多种生物体内存在一种比较保守的线粒体转运蛋白PET8P，该转运蛋白定位于线粒体和叶绿体，能够进行单向和双向的SAM转运。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，包括：在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的PET8P(S-腺苷甲硫氨酸转运蛋白)多肽，从而所述S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。

在一个优选例中，还包括：在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。

在另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括(但不限于)：大肠杆菌SAM合成酶(METK)，酿酒酵母SAM合成酶(SAM2)，大鼠肝脏SAM合成酶或古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶(如P.furiosus S-腺苷甲硫氨酸合成酶)。