[发明专利]一种新型阿魏酸酯酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用宏基因组文库筛选的方法从海底泥样品中获得的一种新型阿魏酸酯酶，以及所述阿魏酸酯酶的应用。

背景技术

木质纤维素(如秸秆、麸皮等)是地球上最丰富的可再生资源，其生成量每年高达5×10¹⁰吨，并且可以通过光合作用年复一年再生，从而越来越受到重视。组成木质纤维的成分主要有纤维素、半纤维素和木质素，木质纤维素的酶解主要通过纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶的共同作用。然而植物细胞壁中富含的酚酸类物质(如阿魏酸、对香豆酸)以酯键的方式在木质素之间、半纤维素之间及半纤维素与木质素之间形成交联，从而构成了一个坚硬的骨架结构，阻碍了木质纤维素的降解利用。可见，打断酯键结构可以有效的降解致密的网状交联结构，在木质纤维素的降解和利用中起着重要的作用。

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，Ferulic acid esterase)是一种可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯及多聚糖阿魏酸酯中的酯键，并将阿魏酸释放出来的羧酸酯水解酶。该酶具有广泛的应用前景，从而引起了越来越多的关注：①水解产物阿魏酸是一种天然抗氧化剂，在食品、化妆品及药品行业中具有潜在的应用价值；②阿魏酸酯酶的作用促进植物原料的脱木质化，减少了纸浆漂白过程中氯的使用，从而减少了环境污染，并且提高纸浆的亮度；③阿魏酸酯酶与其它酶的协同作用可以提高饲料的吸收利用率；④阿魏酸酯酶的作用能够促进植物细胞壁中还原性单糖(如葡萄糖和木糖等)的释放，从而为生产生物燃料提供原料；⑤阿魏酸酯酶可以催化糖类和酚酸合成酯类，通过添加酚类衍生物将糖类聚合物转化为生物活性物质的潜力。因此，深入开展阿魏酸酯酶的研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

上述各种工业应用要求阿魏酸酯酶在不同的pH值和温度下与不同的底物作用，如制浆需要阿魏酸酯酶在高盐碱和高温的环境下作用，然而目前所研究的阿魏酸酯酶的酶学性质在应用方面仍然存在缺陷，限制了阿魏酸酯酶的广泛应用。因此，如何从环境中获得具有优良特性的阿魏酸酯酶，并研究其结构与功能之间的关系，是当前在阿魏酸酯酶研究中面临的一项重要任务。

宏基因组学(Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展兴起的一门新兴学科。该方法是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新型微生物学研究方法。宏基因组学技术在挖掘和利用未培养微生物自愿和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆岛如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。因此，该方法为发现阿魏酸酯酶新基因提供了新思路。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新型阿魏酸酯酶，同时提供一种所述新型阿魏酸酯酶的DNA。

本发明的第二个目的在于提供一种所述新型阿魏酸酯酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供一种含有上述新型阿魏酸酯酶的DNA的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种利用上述表达载体制备重组阿魏酸酯酶的方法，同时提供一种采用此方法所得到的重组阿魏酸酯酶。

本发明的第五个目的在于提供一种上述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。

为实现本发明的第一个目的，采取的技术方案为：一种新型阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为实现本发明的第二个目的，采取的技术方案为：一种如上所述新型阿魏酸酯酶的宏基因组学克隆方法，包括以下步骤：提取南海海底泥样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经Sau3AI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

为实现本发明的第三个目的，采取的技术方案为：一种含有如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA的表达载体。

为实现本发明的第四个目的，采取的技术方案为：一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括以下步骤：用上述所述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组阿魏酸酯酶。