[发明专利]一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学分析技术领域，涉及一种定量检测病毒的方法，特别是一种一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法。 

背景技术

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒属中的某些血清型病毒引起的一种以发热、出血、低血压休克和肾衰竭为主要临床特征的急性传染病。HFRS全球广泛流行，以中国的疫情最为严重，约占全球病例的90％，该病死亡率1％～15％左右。我国的主要流行型别为汉滩型(Hantaan Virus)和汉城型(Seoul Virus)。肾综合征出血热的基本病理改变为全身小血管和毛细血管广泛损害、通透性增加，然而其发病机制至今仍未阐明。汉滩病毒引起的肾综合征出血热是一个多因素参与的过程，汉坦病毒感染直接损伤以及病毒感染后引起的免疫病理损伤可能在疾病发生发展中共同发挥作用。 

汉坦病毒感染机体后，无论通过哪种致病机制引起疾病的发生，了解病毒载量在疾病过程中的动态变化规律及其与疾病严重程度的相关性，有助于了解在疾病进展中病毒与机体的相互作用以及病毒对机体的影响，为临床判断病情、制定合理的治疗方案及进一步深入研究HFRS的发病机制提供重要的实验依据。 

一步法实时荧光探针定量逆转录聚合酶链式反应是检测RNA病毒载量的灵敏度高、特异性好，操作安全简便的方法。汉坦病毒其他型别包括多普 拉病毒(Dobrava Vires)、普马拉病毒(puumala Vires)及新诺伯病毒(Sin Nombre Vires)载量的一步法实时荧光探针定量逆转录聚合酶链式反应检测方法有研究报道，然而国内外至今未见汉滩病毒载量与疾病关系的研究，也未见一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法的研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，不仅可以定量检测，而且特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合于肾综合征患者血浆及其他组织或体液中汉滩病毒载量的定量检测。 

为了实现上述任务，本发明采用的技术解决方案是： 

一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，其特征在于，该方法利用汉滩病毒定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。 

所述的汉滩病毒定量检测标准品是：用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒，体外转录获得76-118株S片段RNA，并通过紫外分光光度计对其准确定量，依据其分子量计算出单位体积内的摩尔浓度作为标准品。 

所述的引物及探针的设计是：在对汉滩病毒标准株及中国流行代表株A16及84Fli的S片段的序列比较分析的基础上，采用Primer 5.0进行引物及探针的设计，引物对间距离为200bp长度以及引物与探针完全与目的片段互补，反转录引物选择随机六聚物，其中： 

上游引物为：5’-TACAGAGGGAAATCAATGCC-3’， 

下游引物为：5’-TGTTCAACTCATCTGGATCCTT-3’； 

探针为：5’-(FAM)ATCCCTCACCTTCTGCCTGGCTATC(TAMRA)-3’。 

所述的一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法是：以定量的体外转录RNA为标准品，调整至合适的浓度后，1∶10倍比稀释10个梯度作为标准曲线，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，患者RNA提取标本为样本，PCR检测反应总体积为25μl，反应体系含样本3μl，一步法酶混合物0.5μl，2×缓冲液12.5μl，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，100nmol/L探针，无RNA酶水补齐到25μl；real time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：42℃：15min，95℃：2min，然后95℃：15s，53℃：30s，72℃：30s，共50个循环，每次循环的72℃延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。