[发明专利]一种南美蟛蜞菊总RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菊科植物总RNA提取的优化方法，适用于南美蟛蜞菊等富含多糖、酚类化合物植物组织总RNA的提取，属于生物技术领域。

背景技术

从植物组织中提取高质量的RNA是进行植物分子生物学研究的必要前提和关键。很多植物组织中富含多糖、酚类等次生代谢物质，造成RNA在提取过程中氧化、褐化和降解，不利于RNA的分离和纯化。针对普通多糖、酚类含量低的植物材料，Trizol类方法产品便可以提取，但一些多糖，多酚及次级代谢产物丰富的植物组织，采用普通的提取方法并不能得到高质量的RNA，常残留大量的多糖、多酚和一些次级代谢产物。细胞在破碎后能释放很多的酚类物质，这些酚类物质极易被氧化成褐色物质而与RNA发生不可逆结合。而多糖的许多理化性质由于与RNA极为相似而很难将两者分开，一方面在去除多糖的同时，很容易将RNA也裹携带走，造成RNA提取量减少；另一方面在沉淀RNA时，多糖和RNA易混合产生凝胶状沉淀，由于多糖能抑制许多酶的活性，被多糖污染的RNA样品很难用于进一步的分子生物学相关实验和研究。由此看来，能否在RNA的提取过程中有效抑制或去除多糖，酚类等次生代谢物是提取高质量RNA的关键。

南美蟛蜞菊是菊科蟛蜞菊属植物，全年常绿，花朵淡雅，着生紧簇，景观效果极佳，加之生性粗放，繁殖容易，是华南地区的重要杂草和园林绿化植物。目前对于南美蟛蜞菊的研究主要集中在生长发育、繁殖特性、药用价值及对其他一些植物化感作用的生理生化机理等方面，而对其分子水平上的研究较少。随着植物功能基因组学的发展，运用分子生物学技术和手段对重要的杂草和园林绿化植物进行遗传改造已成为当前的一个研究热点。因而，对这些重要园林绿化植物的分子水平的研究，如构建cDNA文库、Northern杂交、RT-PCR等就显得十分重要，甚至可以运用转基因的方法对南美蟛蜞菊的花色进行遗传改造，培育具有不同花色的新品种，使其拥有更高的观赏价值，从而更好地发挥其作为地被、造景植物的优势。

发明内容

本发明的目的在于建立一种富含多糖多酚类植物总RNA的高效提取方法，实验操作简单，成本低，重复性好，能获得高质量的RNA，为进行植物分子生物学的研究奠定基础。

本发明所提供的提取南美蟛蜞菊总RNA的方法，按照以下步骤进行：

1）取0.5~1.0g新鲜的南美蟛蜞菊叶片在液氮中充分研磨至细粉状，并快速转移到装有1.5~2mL预冷RNA提取缓冲液的离心管中，振荡混匀后于65℃水浴30min~60min。

 2）加入1.5~2mL氯仿，上下颠倒离心管混匀，4℃，12000~14000r/min,离心10min~15min。

 3）从上层水相中转移900~1200uL至另一离心管中，加入300~400uL 8mol/L的LiCl溶液，混匀后，-20℃沉淀过夜；4℃，12000~14000r/min，离心30min~60min，弃上清，加入500ulTE溶解。

 4）加入500uL氯仿，上下颠倒混匀，4℃，12000~14000r/min，离心10min~15min。

 5）转移400uL上层水相至新的离心管中，加入400uL乙醚，并剧烈震荡混匀，4℃，12000~14000r/min，离心10min~15min。

 6）将300uL上层水相转移到新的离心管中，加入100uL 3mol/LNaAc（pH5.2）和750uL无水乙醇，-50℃放置30min~60min。

 7）4℃，12000~14000r/min离心10min~15min，弃上清，收集沉淀。

 8）沉淀用1mL 70%~80%（体积百分浓度）乙醇洗涤两次，4℃，8000~10000r/min离心，弃上清，室温下自然干燥。

9）用灭菌的DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用。

其中所述的RNA提取缓冲液每100mL中含有：10mL 1M Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8.0，2%（质量体积百分浓度）的CTAB，0.14molNaCl，2%~3%（体积百分浓度）β-巯基乙醇，0.5mol二硫苏糖醇（DTT），2%~4%（质量体积百分浓度）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

其中所述的溶剂氯化锂（LiCl）、醋酸钠（NaAc）、TE缓冲液用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制，灭菌。

其中所述的70%~80%的乙醇用灭菌后的0.1%的DEPC水配制。