[发明专利]同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及农副产品安全检测技术，具体涉及同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法。

背景技术

食品安全是公共卫生问题中最应重视的环节，目前我国食品安全领域存在微生物污染；农产品生产、加工以及销售等环节仍然存在安全隐患；食品安全科技成果和技术储备不足；食品安全标准体系、检验检测体系、认证认可体系等方面还存在明显的不适应性，食品安全管理体制和法律法规体系有待完善；食物中毒和食源性疾病等一系列食品安全问题。

因此只有尽快加强食品安全监控，提高检测技术，建立、健全食品安全法规，使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是食品快速检测技术达到国际先进水平，大力加强食品检验的力度，才能为我国食品安全与食品贸易保驾护航。

食源性疾病定义为，通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、致病性大肠杆菌、葡萄球菌及毒素、变形杆菌属、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蜡样芽抱杆菌、韦氏梭菌、弯曲杆菌、酵米面椰毒假单胞杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、链球菌及志贺氏菌属等。研究发现，人类有60%的疾病都与动物疾病有关，近些年出现的新型疾病中，这一比例更是高达 75%，在养殖业高度发达、人与动物多层面接触的今后，这一比例恐怕还会升高。

实时荧光定量PCR定义为，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

荧光定量PCR方法已被广泛应用于各方面：（1）各型肝炎、艾滋病、胎儿畸形、肿瘤标志物及瘤基因等临床疾病诊断；（2）禽流感、新城疫等动物疾病检测；（3）医学、农牧、生物相关分子生物学定量等科学研究；（4）食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等食品安全的检测。

以上所述的致病菌目前还没有一套可以用荧光定量PCR技术同时检测其是否存在的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一套可同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供根据上述检测引物和探针设计的一种荧光定量PCR检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明针对在我国食物中毒中最常见的致病菌，研究出一种食物中毒诊断及食品检测的有效方法。根据 GB 4789.1 食品卫生微生物学检验总则和GB4789.17 肉与肉制品检验中的相关要求以及结合我国目前食源性致病菌的发生发展情况，选取以下五种细菌作为检测对象：沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌，筛选出检测上述各致病菌的荧光定量PCR引物和探针。

同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针，核苷酸序列如下：

invA组：引物对SEQ ID NO:1~2，探针SEQ ID NO:3；

hly组：引物对SEQ ID NO:4~5，探针：SEQ ID NO:6；

toxR组：引物对SEQ ID NO:7~8，探针：SEQ ID NO:9；

ipaH组：引物对SEQ ID NO:10~11，探针：SEQ ID NO:12；

vcc组：引物对SEQ ID NO:13~14，探针：SEQ ID NO:15；

以上除hly组与tox组不能同时存在外，其他任何两组以上引物及相应探针组合，可以检测该组引物对和探针所对应的致病菌；

其中invA组引物对和探针用于检测沙门氏菌（Salmonella spp.），hly组引物对和探针用于检测单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），toxR组引物对和探针用于检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），ipaH组引物对和探针用于检测福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），vcc组引物对和探针用于检测非O1群霍乱弧菌（Vibrio Cholerae non- O1）。