[发明专利]一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株

权利要求书

1.一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，其特征在于，该病毒株的保藏名称为：猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK^-/gE^-；保藏单位：中国典型培养物保藏中心 ；保藏日期：2012年3月1日；保藏号为：CCTCC V201212。

2.如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX；

（2）TK缺失用转移载体的构建   以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂L_TK；和右臂R_TK;用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E；同样方法消除Hind                                                ，获得质粒PUC19/HE;以KpnI/XbaI双酶切L_TK和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-L_TK;再以XbaI/SphI酶切R_TK和pUC19/HE-L_TK，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-TK;消除pUC19/HE-TK中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-TK;用XbaI酶切pUC19/HEK-TK，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得TK缺失用转移载体pUC19-TK/EGFP;

（3） gE缺失用转移载体构建  以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物对扩增gE同源重组左臂LgE和右臂RgE；以KpnI/XbaI双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE；再以XbaI/SphI酶切RgE和pUC19/HE-LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE；消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-gE；用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得gE缺失用转移载体pUC19-gE/EGFP；

（4） TK缺失重组病毒拯救

转染：在六孔细胞培养板上培养BHK21细胞，待BHK21细胞长满90%时进行转染；取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒pUC19-TK/EGFP混合后转染，同时设仅含转移质粒的对照组；

鉴定：PRV-GDXX基因组与pUC19-TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP;

将PRV/TK-/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK^-；

（5）TK/gE双基因缺失重组病毒拯救

转染：在六孔细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞长满90%时进行转染；取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒共转染，同时设仅含转移质粒的对照组；

鉴定：PRV/TK-基因组与pUC19-gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；

转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/gE-/EGFP；将PRV/TK-/gE-/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-/gE-。

3.包含如权利要求1或2所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。

4.如权利要求1或2所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株在制备猪伪狂犬病毒基因工程疫苗上的应用。