[发明专利]基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子单核苷酸多态性均相检测法

权利要求书

1.一种用于测定样品中ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：（1）从样品中得到提取物：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，并纯化，得到纯化的提取物； （2）扩增结合：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP(dGTP、dCTP、dATP和dTTP)，2.0～3.5mmol/L的MgCl2，1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，浓度为0.2-2.0μmol/L的ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性区DNA的上游引物、下游引物，以及浓度为0.05-0.2μmol/L的ERCC1基因Codon118 C/T单核苷酸多态性的带荧光标记的DNA探针，所述反应条件是：94-96℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，53-63℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45个循环，最后室温孵育；（3）检测：检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.)，t检验统计阴、阳性对照反应终液FP值分布:最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S.D.)<阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S.D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)+FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCC1基因Codon118单核苷酸多态性：

待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，

待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源,

待测样品FP值>阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶位点状态无法判断，需重新检测。

2.权利要求1 的检测法，其中步骤（1）包括：在试剂或试剂盒中进行处理获取基因组DNA；其中所述获取基因组DNA的试剂或试剂盒为内含蛋白酶K、细胞裂解液的DNA提取液，及内含酚／氯仿、乙醇或DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱的试剂，回收的DNA通过PCR来扩增，在PCR扩增过程中，ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性保持不变。

3.权利要求1或2的检测法，其中所述引物为ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性区DNA的通用的上游引物、下游引物，所述5’端带荧光标记的探针为ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性同源的探针，能够与所获得的扩增子结合以产生能够检测的荧光偏振值变化；荧光偏振仪检测所述各反应终液以获得荧光偏振测量值；以及将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值为对照反应终液FP均值、Cut-off值。