[发明专利]重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，本发明涉及重组杆状病毒的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的表达系统。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配，因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。由于杆状病毒表达系统具有安全、高效、容量大、重组病毒易于筛选、表达产物能进行折叠和修饰具有生物活性等特点，可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，使其被广泛地应用于药物开发、疫苗、促生长因子、癌基因、抑癌基因蛋白产物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表达调控等多个领域的研究中。而Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是目前最多使用的杆状病毒表达系统，已有几百种动植物、病毒、细菌、真菌基因在昆虫细胞内得到高效表达。

杆状病毒的滴度是指制备好的杆状病毒溶液里具有感染昆虫细胞能力的病毒颗粒数量。病毒滴度是衡量病毒感染能力的量化指标，既反映制备的病毒质量，也是重复制备重组蛋白的重要技术数据之一。杆状病毒溶液的成功制备和有效扩增，重组病毒感染宿主细胞制备目的蛋白都需要监控和优化杆状病毒的滴度。为了在BEVS中最大程度地表达重组蛋白质，确定杆状病毒与细胞的合适比例，即，感染复数(Multiplicity of infection，MOI)是非常重要的。为在合适的MOI时感染细胞，必需测定病毒滴度。这对于病毒的扩增和获得新的病毒液时进行重复性表达重组蛋白是必不可少的。

现有的杆状病毒滴度检测方法包括：

1.空斑测定法

该方法的主要原理是病毒感染宿主细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。该方法需时间长，病毒滴度鉴定需要10-14天时间；易受Sf9细胞的质量、单层细胞密度、琼脂糖的一致性、孵育时间和操作者的熟练程度等多种因素影响，试验结果重复性差异较大，检测准确性低，不同实验室之间结果不一样。此外，该方法不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

2.ELISA检测方法

该方法检测病毒滴度需要2天，需要昂贵的专门试剂盒，操作麻烦。不同实验人员之间会有操作差别，不同实验室之间的结果也不一样。此外，该方法仍然不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

3.实时定量PCR检测方法

实时定量PCR技术(real-time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR在常规PCR基础上把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，能提高灵敏度，且在整个实验中，所有反应物在同一溶液中进行，不需要任何后处理过程，被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关。此方法快速，样品的制备和Q-PCR分析只需不到4小时；直接测量病毒液，不需要接种细胞和病毒液稀释和感染等繁琐步骤；并且其敏感性、重复性和相关性好，不同实验人员之间操作差别小。原始数据可以有清晰完整的电子版信息记录，可以很好保存每次实验数据和进行数据的回归比较分析。但现有的QPCR检测方法或者局限于检测单条特异性基因(IL18，参见沈波等，荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究，中国免疫学杂志，2005年，第21卷，第11期：853-855)，或者和ELISA检测方法类似，检测病毒表面蛋白Gp64基因，仍然不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

此外，本领域普通技术人员熟知，引物的设计十分复杂，涉及方方面面的因素。有些引物即便经BLAST比对后发现特异性很高，但在实际PCR实验时却还会扩增非目的序列。因此，实际应用中往往难以获得兼具优秀的特异性和通用性的引物。