[发明专利]一种纤维素酶系的选择性失活方法

说明书

技术领域

本发明涉及纤维素酶，具体涉及一种纤维素酶系的选择性失活方法。

背景技术

里氏木霉（Trichoderma reesei）是研究和制备纤维素酶最常用的经典菌株之一，通过底物的诱导和发酵调控作用它可以分泌出多种不同类型的聚糖水解酶蛋白组分，进而组成不同的酶系或复合酶系；其中，纤维素酶系主要包括内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG）、外切葡苷聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91，又称CBH）和纤维二糖酶（β-1,4-D-glucosidase，EC 3.2.1.21，又称β-葡萄糖苷酶，简称β-G或BG）三大酶系，目前已经发现了8个EG（EGI ~ EGVIII）、2个CBH（CBHI和CBHII）和7个BG（BGI~BGVII）酶家族。

在木质纤维原料聚糖类的酶水解过程中，通过上述三大酶系的协同作用可以催化纤维素或半纤维素为聚糖最终水解生成单糖。随着功能性多糖和低聚糖类在细胞生物合成和调控领域、食品、保健品、医药和饲料等领域的基础研究和应用的快速发展，聚糖定向酶水解技术的研究和开发备受关注，对具有单一功能或催化活性的酶家族或酶组分的需求日益增长。目前采用的主要技术途径一是通过外源单一内切酶或外切酶基因的重组表达，二是对天然酶制剂进行蛋白质拆分以控制和除去纤维素系中的BG酶组分，它们在大规模工业化生产中存在着技术复杂、研发周期长、设备及操作要求高、前期投入和运行成本高等不足，因此寻求简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法显得尤其重要，具有重要的理论和实用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种纤维素酶系的选择性失活方法，以里氏木霉产天然纤维素酶及其他相关的复合酶系为材料，通过采用简单的pH值处理的方法对其三大酶系进行选择性失活处理，实现对纤维素酶系的简单、快速和选择性失活。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种纤维素酶系的选择性失活方法：控温5~40℃，调节纤维酶液的pH不小于8，静置处理10~80min，即可选择性失活纤维素酶系；其中，CMCase和CBH选择性保留，BG选择性失活。

所述的纤维素酶系为里氏木霉产的天然纤维素酶复合酶系及其他相关的复合酶系。

用含有Na⁺的碱液或缓冲液，或用含有K⁺的碱液或缓冲液，调节纤维酶液pH。

所述的pH=8.8~9.2。

有益效果：本发明的纤维素酶系的选择性失活方法，简单，快速，容易操作，仅需通过采用简单的pH值处理的方法就可以实现对纤维素酶系中的三大酶系进行选择性失活处理，是一种简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法，具有重要的实用价值，有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是纤维素酶系碱性失活的酶活力测定结果图；

图2是处理温度对纤维素酶系碱性失活的影响结果图；

图3是处理时间对纤维素酶系碱性失活的影响结果图；

图4是碱性条件下处理前后纤维素酶水解动力学的比较结果图；

图5是碱处理纤维素酶定向水解纸浆的糖组成测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例是使用的纤维素酶系采用发酵制备，所使用的菌种为里氏木霉（Trichoderma reesei Rut C-30），方法为：采用Mandels营养盐添加12 g/L纸浆和蒸汽爆破玉米秸秆混合底物为碳源，在250 mL玻璃摇瓶中装液45 mL并接入5 mL活化后的里氏木霉菌丝体，于30℃和170 r/min振荡发酵产酶96h得发酵液，经4000 r/min离心10 min后取上清液即得到纤维素酶系原液，分装后冷冻保藏备用。

酶活力测定方法为：采用双平行实验，控制平行误差≤5%。滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力（CMCase）和外切葡聚糖酶活力（CBH）均采用DNS法测定，β-葡萄糖苷酶（BG）采用对硝基苯酚葡萄糖苷法测定。上述各种酶活力测定均采用0.05 mol/L柠檬酸—氢氧化钠缓冲液体系（pH4.80）和50℃±1。纤维素酶原液中上述各种酶活力值依次为5.81 FPIU/mL、38.01 IU/mL、3.60 IU/mL和1.13 IU/mL。

实施例1