[发明专利]一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法。

背景技术

卵巢癌是常见的女性生殖器官的肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌，居于第二位。目前I期卵巢癌患者5年生存率可达90％以上，而晚期患者仅低于20％。由于卵巢深藏在骨腔内，不易检测；且患者早期常无症状，部分患者只有轻度不适反应，如腹部不适、腹部包块、压迫症状、月经紊乱及内分泌症状、消瘦等。正是由于患者早期症状不明显，故常常导致早期诊断失败。可见提高卵巢癌患者生存率的最好办法是及时准确的早期诊断。

人附睾蛋白4(HE4)编码基因最早是由Kichhoff等人于1991年从附睾上皮远端分离出来，是一种分泌的糖基化蛋白，位于染色体20q上，全长为12kb左右；通过cDNA微阵列分析，发现HE4的mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中不表达，其后越来越多的实验说明HE4具有卵巢癌诊断的价值，在中国人群中HE4与CA125联用能极大地提高诊断卵巢癌的特异性和准确性。因此HE4是卵巢癌诊断具有突破性的新标志物。

体外诊断试剂产品质量最密切相关包括各种活性抗原、重组抗原、单克隆抗体和多克隆抗体等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、中和反应用抗原或抗体、制备校准品(标准品)等。糖基化和高纯度的HE4重组蛋白是卵巢癌诊断试剂研发的重要基础，但目前的现有生产技术还不够完善。中国专利申请CN101802014A公开了一种使用杆状病毒表达系统生产HE4蛋白的方法，虽然杆状病毒表达系统属于真核表达系统，具有真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力，但这种蛋白的修饰有一定限度，也无法产生复杂的糖基侧链，造成生产的HE4蛋白无法保持其天然状态。

因本领域目前上没有成熟稳定的用于卵巢癌诊断的体外表达HE4的方法，因此迫切需要开发一种可以大量制备分子结构、理化特性和生物学功能都接近于天然HE4蛋白质的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法。

本发明的另一目的是提供一种分离的、重组表达的糖基化人HE4蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的、重组表达的糖基化人HE4蛋白，所述蛋白的表观分子量为11kDa-22kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的表观分子量约为19kDa-22kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的表观分子量约为21kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。

在另一优选例中，所述蛋白具有或不具有His标签。

在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为人胚胎肾细胞，且所述宿主细胞的染色体整合有编码HE4多肽的多核苷酸，或所述宿主细胞含有编码HE4多肽的多核苷酸的表达载体。

在另一优选例中，所述的人胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞HEK293。

在另一优选例中，所述的HE4多肽来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：鼠、兔、猪、牛、或羊。

在另一优选例中，所述的HE4多肽具有天然序列、或变异序列，或重组序列。

在另一优选例中，所述的HE4多肽具有如SEQ ID NO：3所示的序列。

在另一优选例中，所述的编码HE4多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞含有1-20个含有编码HE4多肽的多核苷酸的表达载体，或1-20个拷贝的编码HE4多肽的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了第二方面所述宿主细胞的用途，所述的宿主细胞用于制备HE4重组蛋白。

在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面所述HE4重组蛋白的方法，包括步骤：(1)在合适条件下培养本发明的第二方面所述的宿主细胞，获得含有HE4重组蛋白的培养物；(2)从步骤(1)的培养物中分离和/或纯化所述的HE4重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为对制备的HE4蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。