[发明专利]用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及少数的急性粒细胞白血病(AML)患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血病是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此诊断成立后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。

人类abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2～11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1～63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。慢性粒细胞白血病的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。

在实际应用中，用于检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平的方法主要为荧光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时检测，可准确反映患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)的表达情况，节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BCR/ABL(b3a2，b2a2)的基因检测。

发明内容

鉴于现有技术中检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的试剂盒。

用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAce qPCRRT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：

检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/b2a2-R，探针b3a2/b2a2-Probe，检测内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，

b3a2-F：GATTTAAGCAGAGTTCA

b2a2-F：TGTGTGAAACTCCAGACTGT

b3a2/b2a2-R：TCCTTGGAGTTCCAACGA