[发明专利]牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，尤其是一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法。

背景技术

动物乳腺组织特异性高效表达载体是研制乳腺反应器的重要生物元件，外源基因在动物乳腺中的高效表达必须依赖好的表达载体。

酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，牛奶中存在着4种酪蛋白，分别为αS1酪蛋白、αS2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白，其中αS1酪蛋白在牛乳蛋白中含量最高，约为13g/L。牛酪蛋白基因座位存在座位控制区域(locus control region，LCR)，因而使得酪蛋白基因可以成为一个完全独立的表达单位。牛αS1-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体，可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。要在乳腺中表达外源基因，必需有一个高效的、乳腺特异性表达的启动区，显然，牛αS1酪蛋白基因的启动区是最好的候选启动区。

牛αS1-酪蛋白基因全长17508bp，其中19个外显子占1138bp，大小在24～385bp；18个内含子占16370bp，长度为90～1967bp。53bp的第1外显子为5′非翻译区，信号肽基因以及成熟蛋白质的前2个氨基酸由63bp的第2外显子编码。第18外显子和含有polyA信号的第19外显子为3′非翻译区。除终止密码子UGA是由第17外显子的最后2个碱基UG和第18外显子的第1个碱基A经剪切后拼接而成外，其余三联体密码子均不受剪切影响，因此第3到第16外显子都是三碱基对的倍数。16个编码外显子中有9个均以“GAX”起始，这与cDNA序列分析结果一致。序列中主要的磷酸化位点是由第10外显子的第1个密码子(GAA)与前一外显子拼接后产生。

牛αS1-酪蛋白基因的重要调控元件均位于启动区-400～-10。利用乳蛋白基因启动区进行乳腺特异性表达的转基因试验表明，只要乳蛋白基因启动区包括了-500～+500的区域，一般就能够进行高水平的乳腺特异性表达。从牛αS1酪蛋白基因启动区来看它不具有CAAT盒，TATA盒序列“TTTAAAT”为一弱启动区，但牛αS1酪蛋白基因的表达量却很高，因此推测除了5′端调控机制外，内含子及3′端在表达过程中会起到一定的作用。内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。将成熟的mRNA直接注射到核中，当它被运送到胞质中时并不能进行翻译，而在注射核酸结合蛋白的抗体或mRNA的3′端非编码区包含1个可剪接的内含子时，上述抑制被解除。有很多试验都表明采用基因组基因表达构件比采用cDNA表达构件提高表达量10～100倍。此外，异源内含子(特别是第1、2内含子)可提高外源基因(特别是以cDNA为表达构件)的表达效率。此外，内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。

LoxP(locus of X-over P1)序列来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Loxp位点与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

绝缘子是一种顺式作用元件。长约数百个核苷酸对，通常位于启动子正调控元件或负调控元件之间的一种调控序列，可防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。

目前所具有的乳腺特异性表达载体虽然已经不断开发出来，但并不丰富，表达效果各有偏重，通过检索，我们检索到公开号为：CN 1873011A，名称为：高表达水平的转基因动物乳腺特异性载体的构建方法，及申请号为：200810105011.0，名称为：乳腺特异性表达载体及其构建方法，的相关发明专利，但以上发明专利的乳腺特异性表达载体与本发明的乳腺特异性表达载体构成有着本质的不同，其表达效果也不相同。

发明内容