[发明专利]苯妥因检测方法

权利要求书

1.一种苯妥因(5，5-Diphenyl-2，4-imidazolidinedione)的均相酶免疫检测方法(Homogeneous Immunoassay)，使用苯妥因的均相酶免疫检验试剂，该检测试剂由苯妥因特异性抗体和苯妥因酶标偶联物组成，包括以下操作步骤：

(1)采用全自动生化分析仪，将待测样本与苯妥因检测试剂分别放入样本仓和试剂仓；

(2)按照下表进行检测项目参数设置；

(3)测定OD340nm的吸光值；

(4)制作标准曲线来定量样本中的苯妥因浓度；

上述操作步骤(2)还可以通过以下优选方案实现。

所述抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物后生产得到，

所述的苯妥因免疫原，其结构式如式(I)所示：

式(I)

式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。

R为-O-(CH₂)_n-COO-，-S-(CH₂)_n-COO-，-NH-(CH₂)_n-COO-或-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数。优选R为-O-(CH₂)_n-COO-，n值是1至10。更优选R为-O-(CH₂)₄-COO-；所述载体为具有免疫原性的物质，常选用蛋白质。优选为血清蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更优选为牛血清蛋白。

苯妥因酶标偶联物的制备方法如下：

(1)酶溶液制备：称取酶，选自β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate Dehydrogenase，G6PDH)，优选G6PDH，在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为2-6mg/mL；

(2)用有机溶剂溶解链接R连接基团的苯妥因衍生物，使其终浓度为10-50mg/mL，通过三丁胺法进行活化，并与酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到苯妥因酶标偶联物，所述的有机溶剂选自DMF、DMSO、甲醇或乙醇，优选地，有机溶剂为DMF。

2.根据权利要求1所述的苯妥因的均相酶免疫检测方法，其特征在于所述的检测试剂制备方法包含以下步骤：

(1)将抗苯妥因特异性抗体以1∶1000-1∶10000的体积比稀释到均相R1缓冲液中，均相R1缓冲液含50mM Tris，0.25％牛血清蛋白，50mM葡萄糖-6-磷酸和50mM烟碱腺嘌呤二核苷酸；

(2)将苯妥因酶标偶联物以1∶1000-1∶10000的体积比稀释到R2缓冲液中，R2缓冲液含100mM Tris，0.25％牛血清蛋白；

所述的抗苯妥因特异性抗体与R1缓冲液的体积比优选为1∶1000-1∶4000；

所述的苯妥因酶标偶联物与R2缓冲液的体积比优选为1∶1000-1∶4000。