[发明专利]一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法

权利要求书

1.一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，包括：

1)以染色体片段置换系AIS34为母本、轮回亲本Asominori为父本进行杂交，从杂种BC₁F₁代开始，在杂交后代群体中，选择植株花粉育性和小穗育性都为半不育的植株与轮回亲本Asominori再进行杂交；

2)上述AIS34/Asominori//Asominori回交群体的单株种植后进行2个分子标记ZZ1和ZZ2的辅助选择：苗期各单株取叶片提取DNA，用ZZ1标记引物：ZZ1-F：SEQ ID NO.1，ZZ1-R：SEQID NO.2，扩增上述各单株DNA，既能扩增得到193bp条带又能扩增到182bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度182bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株；选择既能扩增得到193bp条带又能扩增到182bp条带的含杂合片段的植株与轮回亲本Asominori再进行杂交；

另一个分子标记ZZ2位于染色体置换片段的下端，ZZ2标记引物：ZZ2-F：SEQ ID NO.3，ZZ2-R：SEQ ID NO.4，扩增上述各单株DNA，既能扩增得到218bp条带又能扩增到195bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度195bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株；选择既能扩增得到片段长度218bp的条带又能扩增到195bp条带的含杂合片段的植株与Asominori再进行杂交；

对获得的植株再进行表型的鉴定，选择植株花粉育性和小穗育性为半不育的单株，生育期、株高、株叶形态与轮回亲本Asominori一致的单株种植；选择4代后，自交一代，获得较大的分离群体进行花粉育性和雌配子育性基因的定位；

3)通过分子标记ZZ1选择得到在该标记位点为杂合状态的带型，而在ZZ2为纯合状态的带型为只有花粉半不育的单株，通过分子标记ZZ1在该标记位点为纯合状态的带型，而在ZZ2为杂合状态的带型为只有小穗半不育的单株；在分离群体中进一步开发分子标记，分别将花粉不育基因和雌配子不育基因进行精细定位。

2.根据权利要求1所述的一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)用AIS34与Asominori杂交，提取AIS34、Asominori和AIS34/Asominori F₁的叶片基因组DNA，合成第5染色体上引物：RM6300、RM7029、RM2010、RM5796、RM1024、RM5374、RM3345、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6、ZZ7、ZZ8、ZZ9，对两个亲本和F₁进行分子标记检测，当连续多个标记在两亲本IR24和Asominori间具有多态性，而这些标记在AIS34/Asominori F₁中的DNA条带与Asominori相同时，则可认为置换的IR24染色体片段结束；

(2)AIS34/Asominori杂种雄配子不育基因的精细定位

AIS34/Asominori杂种不育基因的初步定位用AIS34/Asominori//Asominori回交群体，分别用花粉育性和结实率对引起AIS34/Asominori杂种F₁不育的基因进行初步定位；然后，再分别用花粉不育株和结实率低育株的单株与轮回亲本Asominori回交，根据基因初定位的结果，用分子标记ZZ1引物对ZZ1-F/ZZ1-R，对回交群体中花粉育性的个体进行基因型检测，选取在不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体，与Asominori再回交，同时进行表型鉴定和分子标记检测，直至BC₄F₁，然后自交得到分离群体进行精细定位；

(3)AIS34/Asominori杂种雌配子不育基因的精细定位

在AIS34/Asominori//Asominori回交群体中低育性的个体进行基因型检测，选取不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体再自交，用分子标记ZZ2引物对ZZ2-F/ZZ2-R，对所有的不育株和可育株进行分子标记检测，筛选出仅在不育位点有差异的不育株和可育株，经多代的回交和自交后，这样的不育株和可育株可看作近等基因系；在不育株和可育株近等基因系构建过程中，由于每一代均进行分子标记检测和表型鉴定，尤其在自交后代中，可获得大规模的自交群体，同时，通过自交，与杂种不育无关的位点将逐步纯合，这样在不育位点附近可不断加密分子标记，不断缩小不育位点两侧的分子标记距离，直至逼近该位点，最终精细定位。