[发明专利]多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用多重PCR技术来检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型，特别是食源性病原微生物的技术。 

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起多种严重感染。在显微镜下排列成葡萄串状，直径0.8um左右 。无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性，易与其他细菌区分。同时它的营养要求较低，在需氧或兼性厌氧的条件下均可生长，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，现已鉴定出的肠毒素有A、B、C₁-C₃（根据等电点不同将C分为三种类型）、D、E、G、H、I、J、L、M、N共14种，一般说来，食物中毒时A、D型常见，B、C型次之，涉及到E毒素的发生率最低，各肠毒素毒力不一，其中A型毒素毒力较强，D型较弱。 

目前，随着科学技术的快速发展，分子技术尤其是多重PCR技术在食品检测领域中发挥了重要的作用。目前国内外研究的多重PCR方法主要有NARESH K. SHARMA等人建立的一种多重PCR检测肠毒素A～E，利用了几种毒素基因的通用保守序列及特异序列，即一个相同的上游引物及特异性下游引物，可在3～4h内检测出毒素基因A～E，且与标准的免疫检测有近99%的对应性（Sharma，2000）；利用16sRNA和23sRNA间的间隔序列DNA做为模板，由于其被认为是非功能性片段，因此其变异性比16sDNA高10倍，可以有效地区分种间差异，P. Phuektes等人利用该序列进行的多重PCR可以同时鉴别四种乳房炎病菌：S. aureus，S. agalactiae，S. dysgalactiae和S. uberis（P. Phuektes，2001）。更有甚者，通过两个PCR反应体系、两对引物同时检测了包括肠毒素SE、TSST-1、Ets、mecA在内的十种毒素基因，且效果很好，有很好的应用前景（Mehrotra，2000）。国内学者对于肠毒素的研究主要运用在对致病菌的快速检测中。杨小娟等对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种食源性致病菌建立多重PCR检测技术，分别以沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌taxR基因和单核细胞增生性李斯特氏菌iap基因为靶基因，建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系，扩增产物分别为495bp（invA）、368bp（taxR）和660bp（iap）。建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的同时检测，人工污染水产品检测限为10cfu/mL。为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段，有良好的应用前景（杨小娟，2008）。 

    但是目前还没有专门用多重PCR方法针对金黄色葡萄球菌常见的肠毒素基因型进行研究，而且没有内部对照。中国专利公开号CN101113472A、申请号200710057579.5公开了《运用复合荧光PCR技术检测食源性病源微生物的方法》，也与本实验的多重PCR技术不是一个概念，技术原理不一样。 

  

发明内容

针对金葡菌常见肠毒素基因型，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法。该方法可在同一反应体系中，同时检测出产A、B、C、D型肠毒素的金黄色葡萄球菌。 

该方法包括：应用该方法检测食源性病原微生物所使用的引物组和与之配套的PCR反应条件，引物序列如下表1： 

                  表1各引物序列

同时，本发明还提供了更加准确和低成本通过多重PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

（1）设计各肠毒素基因型的特异性引物用于多重PCR技术检测；

（2）整合各引物使之不互相干扰；

（3）以引物系列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

（4）扩增过程在PCR仪上进行并在PCR反应结束后将所合成DNA片段进行电泳及观察结果。