[发明专利]一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法，具体涉及以制备的基因工程共固定化木聚糖降解酶为催化剂，然后将其作用于木聚糖溶液进行酶解反应制备制备低聚木糖和木糖。

背景技术

低聚木糖又称木寡糖，由2～7个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成，以木二糖，木三糖为主。各项研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖，具有显著的双歧杆菌增殖能力，不被消化性，无龋齿性以及促进人体对钙的吸收等特性，因此，低聚木糖作为一种新型功能性低聚糖成为食品工业研究开发的热点之一。木糖作为食品添加剂主要用于糖尿病患者的甜味剂，在工业上是印染和制革业中的助剂。而随着木糖醇作为糖尿病患者治疗剂的广泛应用，以及木糖醇作为甜味剂用作防龋齿口香糖、糖果、饮料等的开发，作为木糖醇生产原料木糖的酶法制备技术，也倍受人们广泛关注。木聚糖类半纤维素在自然界存在多样性，包括了葡萄糖醛酸木聚糖(硬木)、阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖(软木、禾本科植物：秸秆)以及阿拉伯木聚糖(小麦)等，分别存在于不同的植物中。秸杆半纤维素属阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖，是一条以β-1，4糖苷键相联的木聚糖主链，平均每6个木糖单元就带有一个1，2-4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝，每8～9个木糖单元带一个1，3-α-L-阿拉伯呋喃糖侧枝，因此，酶法水解秸杆木聚糖制备低聚木糖和木糖需要系列木聚糖降解酶：β-1.4内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-D-葡萄糖醛酸酶，有的木糖苷酶同时也是阿拉伯糖苷酶即双功能酶。发明人的以前专利(ZL200410044977.X.；ZL200510038237.X；CN1884569A)中，利用系列木聚糖降解酶(葡萄糖醛酸酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶)的联合作用木聚糖不仅加速木聚糖产生木寡糖的反应速度，而且使酶解产物中带有葡萄糖醛酸或阿拉伯糖侧枝的大片段得到进一步水解，提高了产物的产量和纯度。因此，高效酶促转化秸秆木聚糖制备低聚木糖和木糖需要大量生产2至4种游离酶。这势必带来能源消耗和成本的大大增加。如多个酶的大量制备、纯化和固定化是需要多步完成，多步操作又会造成酶的损失；同时，产物与酶分离回收困难，酶利用效率低。因此，找到一种多酶制备简单又成本低且可反复回收利用的低聚木糖和木糖高效制备的途径非常有意义。

目前重要的亲和标签肽有聚组氨酸和谷胱甘肽-S转移酶，已广泛用于实验室规模的纯化，但由于其所用载体材料，如琼脂糖，聚丙烯酰胺和玻璃珠需要高成本的化学修饰，因而至今未得到工业应用，而纤维素结合域作为一个更具应用价值的亲和多肽，却因其分子量过大，与目的蛋白融合后影响所固定蛋白的生物学活性存在不足。几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，ChBD)因其氨基酸数量少，对目的蛋白活性的干扰也相应减小，而且几丁质是世界上第二大类多糖，来源广泛、价格低廉、理化性质稳定、无毒和易于制成适宜形状，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此，几丁质结合结构域更适合用于生物亲和固定化技术。但是，现在使用的ChBD标签为来源于常温菌环状芽孢杆菌(Bacilluscirculus)，其在高温条件下与几丁质基质的结合力较弱，限制了其在高温酶固定化的应用。因此，找到一种在高温下能与几丁质基质的结合力强、同时又不影响蛋白质功能的的高效稳定的亲和标签是解决高温酶固定化应用的关键。

发明内容

本发明的原理是，通过基因重组技术将木聚糖降解酶带上一个在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行共表达，然后与固定化载体材料特异结合从而构建一个基因工程共固定化木聚糖降解酶用于秸秆木聚糖底物制备低聚木糖和木糖。

本发明目的之一是通过基因重组技术将木聚糖降解酶带上一个在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行表达，然后与固定化载体材料特异结合制备一个基因工程共固定化木聚糖降解酶，以期达到简化多酶制备为一步生产，且酶纯化与固定化同步，产物的分离回收和酶连续再使用相偶联的高效和低成本制备技术。该法获得的共固定化酶，其载体与酶结合力强、特异性好和稳定性高，可以多次回收利用，既减少环境污染又提高生物质的利用率，具有广阔的工业应用前景。

本发明目的之二是提供一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶作为催化剂，在温和的反应条件下制备低聚木糖和木糖的方法，通过对基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的工艺条件的优化，达到系列木聚糖降解酶之间的协同作用，催化效率高，反应副产物少，产量和纯度高的生产工艺。