[发明专利]一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法

说明书

1.发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新布尼亚病毒(SFTS bunyavirus)纯化灭活疫苗的制备方法。

2.发明背景

新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus，SFTS Bunyavirus)，是发热伴血小板减少综合症(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome，SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。到目前为止，全国已有河南、江苏、湖北、山东、安徽和辽宁等16个省发现300多病例，造成40余人死亡。中国国家疾控中心、江苏省疾控中心先后成功的分离到该病病毒，并对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，但是对SFTS尚无特效药治疗和疫苗预防。

3.发明内容

本发明的目的之一在于提供了一株新的，用于制备灭活疫苗的新布尼亚病毒JS-2007-001，该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus；Novel Bunyaviridae)，其保藏号为CCTCC V201211；保藏时间为2012年3月1日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。

本发明的目的之二在于提供了将上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备成为纯化灭活疫苗的方法。

本发明的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本发明中涉及的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的纯化灭活疫苗。

具体的，本发明涉及了一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：1)采用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞；2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种；3)接种、培养，收集病毒滤液；4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入病毒保护剂，并检定合格后制备成品疫苗。

在所述的制备方法中，其中所述的接种人二倍体MRC-5细胞的毒种为经二倍体细胞MRC-5传代适应的毒种，该毒种滴度按CCID₅₀法不低于7.01gCCID₅₀/mL。

上述制备方法的培养步骤具体为：

1)制备人二倍体细胞培养液。所述人二倍体细胞培养液为含10％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％NaHCO₃、2mM谷氨酰胺的MEM培养基；

2)采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞，其按1∶2或1∶4进行细胞传代，37℃培养，待细胞成片后接种二倍体细胞毒种；

3)接种病毒。包括倒去培养液，加入浓度为100～1000CCID₅₀/mL病毒，其MOI为0.001～0.0001；将接种病毒后的细胞置于33℃～35℃12小时，使病毒与细胞充分接触吸附；然后倒去病毒液，用0.01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗；最后加入pH7.4～7.6DMEM溶液，送入33℃～35℃恒温室进行培养；

4)将病毒培养144～168小时，当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒；收获的病毒液按1∶4000加入β丙内酯，灭活72小时后进行浓缩纯化；

5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂除菌，检定合格后即为疫苗原液，再经分装，各项检验合格后制成疫苗。

本发明所述的制备方法获得的疫苗主要质量指标为：病毒滴度≥7.01gCCID₅₀/mL；疫苗免疫剂量：0.5mL/剂/人；抗生素残留量：≤50ng/剂；牛血清残留量：≤50ng/剂；热原：≤20EU/剂；疫苗pH：7.4-7.8；热稳定性：符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力：15μg/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥90％保护作用；无菌检查：符合2010年药典第三部标准；支原体检查：符合2010年药典第三部标准；异常毒性试验：符合2010年药典第三部标准疫苗。其它各项指标符合2000版《中国药典》标准。

4.附图说明

图1为人二倍体细胞MRC-5制备新布尼亚病毒灭活疫苗方法。