[发明专利]一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种能耐受高浓度丁醇的梭菌，其特征在于，含有htrA基因，所述htrA基因的序列为SEQ ID NO.1；所述htrA基因编码的蛋白质HtrA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.一种如权利要求1所述能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）pIMPI-Thl质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824基因组作为模板，利用PCR扩增141 bp的乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列，将乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列经Sal I和BamH I酶切后与pIMPI质粒连接，得到pIMPI-Thl质粒；

（2）htrA基因过量表达重组质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824基因组作为模板，利用PCR扩增1302 bp的htrA基因，将htrA基因与步骤（1）所得pIMPI-Thl质粒进行连接从而构建pITHtrA质粒；将重组质粒转入E. coli TOP10(pAN1)中进行甲基化，得到甲基化质粒pITHtrA；

（3）htrA基因过量表达重组菌株的构建：厌氧条件下，取60-120mL梭菌强化培养基培养的对数中后期的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824细胞液，4℃、3000rmp离心10分钟，去除上清液，加入60-120mL预冷的电转缓冲液，洗涤两次，并重悬至1.5mL的电转缓冲液中，然后取30-50                                                L转入0.4cm的电转杯中，放置冰浴中用于电转化，加入100-300g步骤（2）所得甲基化质粒pITHtrA，置于冰浴中2-3分钟，采用2000v脉冲电压和25F的电容进行电转化，随后将电转液加入到梭菌强化培养基RCM中，37℃培养4-6小时，2000-3000rmp离心10分钟收集细胞，将收集的细胞涂布于含有红霉素抗性的RCM琼脂培养基上，培养36-40小时后，获得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌，命名为酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA)；

所述梭菌为可产丁醇的梭菌；

（4）重组菌的丁醇耐受性检测：培养步骤（3）所得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌重组菌至对数生长初期OD_600nm=1.0±0.2，厌氧条件下分别分转至含有不同浓度丁醇的培养基中，以含有pIMPI 空质粒的梭菌作为对照，37℃条件下继续培养，于不同时间测定培养基OD_600nm的变化。

3.根据权利要求2所述能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，所述乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列为SEQ ID NO.3。

4.根据权利要求2或3所述的能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，所述电转缓冲液含270mmol/L蔗糖，5mmol/L NaH₂PO₄ ，pH为 7.4。

5.根据权利要求2或3所述的能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，所述梭菌为产丁醇的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），或Clostridium saccharoperbutylacetonicum和Clostridium saccharobutylicum四大类梭菌。

6.一种如权利要求1所述的能耐受高浓度丁醇的梭菌在生产丁醇中的应用。