[发明专利]建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的克隆方法及其realtimePCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种建鲤管家基因GAPDH基因含内含子的部分序列的克隆方法及其real time PCR方法。

背景技术

在实时定量PCR(real time PCR)中，目标基因的相对表达量是通过内参基因的均一化来确定。理想的内参基因应该是它的表达量在不同的组织中恒定，而且不受实验处理条件的影响。大量的研究表明，目前还没有通用的内参基因符合这一条件，最好的选择就是内参基因表达量在自己所研究的样品中变化较小。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解反应中的一个酶，由4个30～40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该基因几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作real time PCR实验操作的管家基因。

在用Trizol提取的RNA样品中，不可避免的会有少量的DNA残留，反转录后，cDNA中还是含有DNA，而DNA同样会作为模板和cDNA一起被扩增，这必然会影响扩增效率，从而影响到实验结果的准确性。为了消除DNA的污染，通常需要将RNA样品进行DNAse酶处理，但这会增加样品被染污的机率，同时也会减少RNA的得率，导致表达量很低的基因甚至无法检测出。最直接的方法就是通过设计跨越内含子的引物来消除DNA的污染，优化反应条件，使样品中的大片段DNA不能被扩增。

建鲤(Cyprinuscarpio var.jian)是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品种，具有生长快、体型佳、肉质好等优良的经济性状，已遍及我国27个省。本研究通过克隆建鲤GAPDH含内含子的部分序列，设计一对跨越内含子的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤GAPDH real time PCR方法，从而为GAPDH作为内参基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

发明内容

发明目的：本发明目的之一在于克隆出建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列；本发明目的之二是基于获得的序列，设计一对跨越内含子的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤GAPDH real time PCR方法，从而为GAPDH作为内参基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

技术方案：

基于现有技术中存在的问题，本发明提供一种建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的克隆方法，按照以下步骤实现：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序；其中所设计的引物序列为：

正向：CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA

反向：GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC

用此方法克隆所得建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列如SEQ ID中No.1所述。

作为本发明的进一步改进，PCR扩增的反应条件如下：95℃ 3min、30循环(94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 1min)、72℃延长8min，4℃度保存。

本发明还提供一种real time PCR扩增图1中所示建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的方法，按如下步骤实现：抽提总RNA，以Oigo dT Primer和Random 6 mers为引物进行RT反应，然后以此RT液为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤引物为跨越内含子的定量引物，其序列为：

正向：AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG

反向：GTGGATACCACCTGGTCCTCTG

作文本发明的进一步改进，real time PCR扩增的反应条件为：94℃ 3min，然后40个循环94℃ 5sec，62℃ 20sec，最后72℃ 3min，4℃保存。

有益效果