[发明专利]一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离与制备微生态制剂的技术，尤其是一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法。

背景技术

鱼类肠道正常菌群是肠道微生物的重要组成成分，是各种生命活动影响因素之一，是在与宿主共同进化过程中形成的，以及二者之间相互作用而成的微生态系，与鱼类营养、物质消化吸收、免疫应答、器官的发育及疾病感染有关。肠道菌群跟据其作用可分为固有菌群和非固有菌群，或者分为原籍菌群Autocht honous flora和外籍菌群Allocht honous flora，这种分类只是相对的。红酵母 Rhodotorula 广泛分布于海洋及淡水环境中，其富含蛋白质、不饱和脂肪酸、多种B族维生素、消化酶及生长因子，同时也能产生一些保健功能活性物质。更为重要的是，红酵母能合成生产以虾青素为主的类胡萝卜素，是相当优质的微生物饲料。目前人们把海洋红酵母Rhodotorula glutinis作为一种水产养殖的益生菌来应用。红酵母属中有许多种类寄附在鱼、虾和贝类的身体上，与其共生，一般不致病，是鱼、虾、贝的开口饵料。斑马鱼Danio rerio作为一种新型模式生物近年来在研究人类遗传、免疫、及生理方面倍受关注。利用红酵母作为观赏鱼和水产品的饲料添加剂，将在防病治病、提高观赏鱼和水产品养殖生产力方面发挥巨大的潜能，并有利于绿色环保型观赏鱼和水产品的生产。

发明内容

为了有效预防观赏鱼及水产品的疾病，减低水产品死亡率，本发明提供一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法，该方法不仅工艺流程操作简便，成本低廉，而且本方法制备的观赏鱼的养殖用红酵母微生态制剂可以起到有效预防观赏鱼和水产品的疾病，增强抗病力的作用，降低病死率，同时不会造成环境污染和抗生素药物残留的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该观赏鱼用红酵母微生态制剂的分离、鉴定与制备方法包括以下步骤：

（1）红酵母的分离：

无菌操作对斑马鱼的体表用 75%的酒精消毒，取其肠道中部，置于盛有10mL 的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，保持培养基内的温度为恒温25-28℃，培养3天；挑选典型菌落转种到新的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，反复传代2～3 次，筛选出目的酵母接种到斜面备用；所述的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基的成分及制备方法为: 去皮马铃薯190-210g，葡萄糖 18-20g及琼脂 13.5-16.5g，由去离子水定容至990-1010 mL，PH值为7-8，115-126℃条件下灭菌18-22min；

（2）红酵母的鉴定

生理生化实验

酵母菌生化试剂鉴定管购自杭州天和微生物有限公司，酵母糖发酵和碳源同化的实验按常规方法进行，保持培养基内为恒温25-30℃，培养2～5天，观察结果。

的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析

提取酵母菌 DNA 后，选取26S rDNA D1 /D2 区的PCR 反应体系进行PCR扩增，将扩增产物送由生工生物工程上海有限公司进行测序，采用 BLAST 和Clustalx1. 83 程序进行26S rDNA 序列比对分析，进而构建系统发育树和置信度检测。

（3）红酵母微生态制剂的制备方法

菌株提取：

取一株（1）中提取的红酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏号为MCCC2A00030，在PDA培养基上保持恒温25-30℃培养3天，在发酵培养基中保持恒温25-30℃、190-210 rpm摇床培养4-6天，该菌26 S rDNA的GenBank登陆号是HQ323251；所述的发酵培养基为：去皮马铃薯190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨2.5-3.5g，KH₂PO₄ 0.9-1.1g ，MgSO₄0.4-0.6g,由去离子水定容至990 -1010 mL， PH值为7-8，在115-126℃条件下灭菌18-22min；