[发明专利]犬囊型包虫病PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病的诊断技术，涉及对犬囊型包虫病的检测方法。 

本发明提供一种检测犬囊型包虫病的通用型PCR试剂盒。本发明的内容涉及一对用来检测犬囊型包虫病的PCR引物，以及一套包含了PCR反应mix(含引物)、阳性对照、阴性对照、溴酚蓝上样缓冲液组成的PCR检测试剂盒以及相应的检测操作程序。 

背景技术

棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病(hydatid disease)，是由棘球属(Echinococcus)绦虫的幼虫——棘球蚴(echinococcus orhydatidcyst)寄生于动物(包括人)体内所致的一类可以严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病，世界各地均有分布。棘球(绦虫)属在分类上隶属于扁形动物门，圆叶目，带科。目前已确认的棘球属绦虫有5种：细粒棘球绦虫(E.granulosus)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)、少节棘球绦虫(E.oligarthrus)、福氏棘球绦虫(E.vogeli)以及石渠棘球绦虫(E.shiquicus)。不同种的棘球绦虫的成虫及其幼虫在形态、生物学特征、致病性等方面均存在有差异。其中，少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫主要分布在中美洲和南美洲，少节棘球绦虫尚无人体感染的确切报告，福氏棘球绦虫的幼虫偶尔可在人体引起多囊性棘球蚴病。而细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的幼虫在宿主体内分别引起囊型包虫病(cystic echinococcosis，CE)和泡型包虫病(alveolar echinococcosis，AE)。我国是棘球蚴病高发区，目前在我国存流行有细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫三种，尤以细粒棘球绦虫最为广泛和严重。 

棘球属绦虫的终末宿主要是以犬科动物为主。其成虫寄生于宿主小肠内，虫卵随粪便排出，污染食物、饮水及周边环境。感染棘球绦虫的终末宿主是棘球蚴病的重要传染源，所以及时、准确地检测流行区终末宿主棘球绦虫的感染情况和对感染动物进行强制驱虫，对控制棘球蚴病的流行、综合防控措施实施和防治效果等均具有重要的意义。 

人在食用被棘球绦虫卵在排出宿主肠道后回污染水源或食物。人在不慎食用污染后的水或食物后即会感染。囊型包虫病的病程缓慢，潜伏期长，约1～30年。症状非常隐蔽，常不易觉察。随着感染部位的囊肿的逐渐膨大，寄生部位的占位性压迫症状以及全身毒性症状逐渐明显。根据棘球蚴所寄生的脏器，可将包虫病分为肝包虫病、肺包虫病、脑包虫病、骨包虫病等。近期有宠物主因宠物犬而感染囊型包虫病而导致骨包虫病的报道。感染初期，棘球坳寄生于骨髓腔内，继而沿骨松质与骨孔蔓延，逐渐破坏骨质，最终可导致骨折。如若囊肿穿破骨皮质而侵入周围软组织，会形成巨大包块。若导致皮肤破溃，则会形成长期不愈的瘘管，脓液与包虫碎屑可由此排出，并会继发慢性化脓性骨髓炎。若累及关节，还可引起病理性脱位。病变初期无明显症状，随着病情的发展，可出现疼痛、麻木、肢体肌肉萎缩。脊椎、骶骨等处的囊肿可压迫神经，产生神经压迫的症状和体征，甚至截瘫。除此之外，虫卵亦可感染眼睛、肾、膀胱、输尿 管、前列腺、精索、卵巢、输卵管、子宫和阴道等泌尿生殖器官等其他部位，心脏、脾、肌肉、胰腺等部位也有棘球蚴寄生的报道，其症状与良性肿瘤相似，同时还可以引发多种并发症，如并发感染、破裂、过敏性休克等，危害巨大。 

由于此病的潜伏期长，且症状隐蔽性大，在感染早期不易发现，因此增强对犬只的检测，从源头上杜绝感染才是防控之本。 

棘球绦虫感染的确诊可根据肠道或粪便中成虫、特异性抗原或特异性DNA分子检出。通常对终末宿主棘球绦虫感染的检测与诊断比较困难，尚未有较理想的方法，其原因在于：(1)在棘球蚴病流行区犬科动物除感染棘球绦虫外，往往还感染其他带科绦虫，棘球绦虫虫卵在形态上很难与其他带绦虫虫卵相区别；(2)在粪便中可能缺少棘球绦虫特征性链体片段；(3)棘球绦虫虫体片段小，在粪便中不易看到或者易被忽视。氢溴酸槟榔碱(或槟榔素乙酰胂胺)泻下法和剖检法是临床上广为使用的方法；近来，随着生物技术的发展，出现了一系列犬科动物棘球绦虫感染诊断和检测的新方法，如粪抗原ELISA法、粪DNA检测方法等正在研究和开发中，并已经获得了初步成功，有助于在临床上提供检测与诊断效率。 

Bretagne等首次报道用PCR技术从狐狸粪DNA中检测多房棘球绦虫感染，从此以后，利用分子生物学检测方法(粪虫体DNA检测法)得到了极大改进。张亚楼等建立了检测家犬粪便中细粒棘球绦虫DNA的PCR方法。