[发明专利]培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法

权利要求书

1.一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）分别制备长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基：取MS基本培养基，以每升加入和6～8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0.1～0.3克萘乙酸、2～4克6-苄氨基嘌呤、0.2～0.4克秋水仙素和6～8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入10~20克氯化钠和6～8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用；

2）长春花无菌苗的制备：以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为0.2%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25+1℃，光照为100μmol·m^-2·s^-1条件下，经4周培养后，得无菌苗；

3）耐盐耐低温长春花株系的诱导：将步骤2所得无菌苗作为种源，接种于诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+1℃、光照为100μmol·m^-2·s^-1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+1℃、光照为100μmol·m^-2·s^-1；随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱；

将步骤1中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别调节pH值至5.8后，高压灭菌；

将步骤1中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基、用HCl或NaOH或两者结合调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值至5.8后，分别高压灭菌，并将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于玻璃三角瓶中。

2.根据权利要求 1所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于：所述玻璃三角瓶的容积为0.1升，所述玻璃三角瓶中长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的体积分别占的玻璃三角瓶25%。

3.根据权利要求 1或2 所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于：所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法：取MS基本培养基，以每升加入和6克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0.1克萘乙酸、3克6-苄氨基嘌呤、0.2克秋水仙素和6克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入10克氯化钠和6克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。

4.根据权利要求 1或2 所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于：所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法：取MS基本培养基，以每升加入和7克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0.2克萘乙酸、3.5克6-苄氨基嘌呤、0.3克秋水仙素和7克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入15克氯化钠和7克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。

5.根据权利要求 1或2 所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于：所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法：取MS基本培养基，以每升加入和8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0.3克萘乙酸、3.5克6-苄氨基嘌呤、0.4克秋水仙素和8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入20克氯化钠和8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。