[发明专利]在牛DGAT1基因中引入K232A精细突变的方法

权利要求书

1.一种牛DGAT1基因中引入K232A精细突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)带有K232A突变的牛DGAT1基因同源短臂的构建

①以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为上、下游引物，以牛基因组为模板，PCR扩增，得到1.8kb的5’端引入了一个Nsi I酶切位点，3’端引入了一个Pme I酶切位点的DGAT1基因同源短臂S，将所述DGAT1基因同源短臂S插入T载体得到质粒pTS；所述DGAT1基因同源短臂S包括部分内含子6，外显子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，内含子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16及部分外显子17；

②以含突变位点的引物SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为上、下游引物，以所述pTS为模板，用高保真酶Pyrobest扩增，将所述DGAT1基因同源短臂S的K232A位点的碱基AA突变为GC；用酶Dpn I处理扩增产物去除模板质粒DNA，酶切产物纯化后转化大肠杆菌DH5α并筛选阳性克隆，经测序鉴定为突变成功，得到载体pTSM；

(2)牛DGAT1基因同源长臂的构建

以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为上、下游引物，以牛基因组为模板，扩增，得到5.5kb的5’端引入了一个Pac I酶切位点，3’端引入了一个Not I酶切位点的DGAT1基因的同源长臂L；所述同源长臂L包括部分内含子1，外显子2、3、4、5、6，内含子2、3、4、5及部分内含子6；

(3)打靶载体的构建

①用Pac I和Not I双酶切所述同源长臂L及pFPC-1载体，连接，使所述同源长臂L插入质粒载体pFPC-1的Pac I和Not I酶切位点，得到载体pL，转化大肠杆菌DH5α；

②用Nsi I和Pme I双酶切所述步骤(1)获得的载体pTSM，回收1.8kb突变后的同源短臂片段，连接到Nsi I和Pme I酶切后的pL载体上，得到打靶载体pLSM；

(4)K232A精细突变的引入

①用Pac I或Pme I单酶切处理所述打靶载体pLSM使其线性化，按照脂质体转染试剂说明书转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo-TK及K232A突变点引入牛DGAT1基因第8外显子，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选；

②用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞进行病毒包装，收集腺病毒，感染步骤①成功同源重组后的细胞株，用Cre酶的活性删除loxp位点当中的筛选基因Neo-TK，用GANC筛选出成功删除Neo-TK后的细胞株；在牛DGAT1基因中引入了K232A精细突变。